回答与转基因植物的培育和植物克隆有关的问题：
（1）农杆菌介导法是目前植物转基因技术的常用方法。使用该方法需先获取活性强的农杆菌菌液，再通过冰浴、离心、去上清液等相应的溶液处理，最后加入适量预冷的含15%甘油的

CaCl₂

CaCl₂

溶液，制成感受态农杆菌细胞。
（2）目的基因和质粒的正确连接是否成功与多种因素有关，为提高重组质粒的形成效率，可用两种不同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，在具有足量酶且其他环境条件适宜的反应体系中，还需要考虑到

限制性核酸内切酶和DNA连接酶（工具酶）的处理时间、加入目的基因与质粒的比例

限制性核酸内切酶和DNA连接酶（工具酶）的处理时间、加入目的基因与质粒的比例

（答出2点即可）等因素，再分离得到高纯度的重组质粒。
（3）将感受态农杆菌细胞的菌液和高纯度的重组质粒在离心管内轻缓混合后，将离心管置于液氮中速冻5min迅速转移至37℃水浴静置5min,再转移至冰浴中静置5min,这一系列操作的目的是

有利于重组质粒进入细胞中

有利于重组质粒进入细胞中

，可以提高转化效率。若重组质粒中的标记基因是卡那霉素抗性基因，再加入适量的

A

A

（填序号），并在28～30℃的摇床上慢速振荡培养1～2h,目的是让菌体复苏、表达抗体和

大量增殖

大量增殖

。
A.不含卡那霉素的LB培养液
B.含有适量卡那霉素的LB培养液
C.含有卡那霉素的人工培养液“199”
D.含有适量卡那霉素的MS培养基
（4）由于植物

细胞壁

细胞壁

（填细胞结构）的存在，植物的组织培养和克隆有一定难度，可以通过使转化成功的农杆菌感染植物的原生质体来解决这一难题，将导入外源基因的原生质体培养成胚性细胞，胚性细胞继续培养，可通过胚胎发生和器官发生两条途径形成转基因植株，请简要写出其中一条从胚胎细胞到形成完整植株的途径：

胚性细胞培养形成细胞团，经球形胚、心形胚和胚状体，最后发育成植株（或胚性细胞培养形成细胞团，细胞团增殖为愈伤组织，先在发芽培养基上诱导生芽，再经过生根培养基诱导生根，形成完整植株）

胚性细胞培养形成细胞团，经球形胚、心形胚和胚状体，最后发育成植株（或胚性细胞培养形成细胞团，细胞团增殖为愈伤组织，先在发芽培养基上诱导生芽，再经过生根培养基诱导生根，形成完整植株）

。