PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：

名称	识别序列及切割位点	名称	识别序列及切割位点
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRⅠ	G↓AATTC CTTAA↑G
PstⅡ	CAG↓CTG GTC↑GAC	PstⅠ	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnⅠ	G↓GTACC CCATG↑G	BamHⅠ	G↓GATCC CCTAG↑G

注：箭头表示切割位点
（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经

逆转录

逆转录

过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入

EcoRⅠ

EcoRⅠ

和

PstⅡ

PstⅡ

两种不同限制酶的识别序列，为此需要将两种酶的识别序列分别设计在两种引物的

5’

5’

端（填5'或3'）。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用

T₄

T₄

（填“E.coli”或“T₄”）DNA连接酶。
（3）转化前需用

Ca²⁺或CaCl₂

Ca²⁺或CaCl₂

处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，以提高转化效率。
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取单菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，

3

3

号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。