研究表明EPA（二十碳五烯酸）能促进体内饱和脂肪酸代谢，具有降低血液黏稠度、预防心脑血管疾病的功效。研究人员利用转基因技术从海洋生物中提取了EPA合成途径的关键基因pfaB，并采用合理且表达效率最高的方案构建基因表达载体，将其导入酵母菌内，通过酵母菌发酵生产EPA。图1表示目的基因（pfaB 基因）及其上的限制酶酶切位点，图2表示质粒的结构示意图。请回答下列问题：

EcoRⅠ	HindⅢ	BamHⅠ	SmaⅠ
5′-G↓AATTC-3′ 3′-CTTAA↑G-5′	5′-A↓AGCTT-3′ 3′-TTCGA↑A-5′	5′-G↓GATCC-3′ 3′-CCTAG↑G-5′	5′-CCC↓GGG-3′ 3′-CCC↑GGG-5′

（1）根据图1分析，利用PCR扩增pfaB基因时所选用的引物是

引物4和引物5

引物4和引物5

，理由是

利用pcr扩增目的基因时，子链的延伸方向是5’端向3’端，扩增产物应该包含酶切位点序列

利用pcr扩增目的基因时，子链的延伸方向是5’端向3’端，扩增产物应该包含酶切位点序列

。
（2）根据图1和图2分析，构建表达效率最高的基因表达载体时，应选择

BamHⅠ和HindⅢ

BamHⅠ和HindⅢ

酶分别切割含目的基因的DNA和质粒，目的是

避免目的基因和质粒自身环化，防止目的基因与质粒反向连接

避免目的基因和质粒自身环化，防止目的基因与质粒反向连接

。
（3）目的基因的检测时，采用PCR等技术可检测

pfaB基因是否插入酵母菌染色体中及是否表达

pfaB基因是否插入酵母菌染色体中及是否表达

。（答出2点）