果胶甲酯酶具有催化水解果胶的作用，为获得高产、高纯度的胞外果胶甲酯酶，如图表示某科研小组设计的黑曲霉工程菌的构建和发酵流程图。
回答下列问题：
（1）科研小组从基因数据库中获得果胶甲酯酶基因序列后，需要根据果胶甲酯酶基因设计 引物引物，以扩增出大量果胶甲酯酶基因片段。利用农杆菌进行转化，在构建重组基因表达载体时，应将果胶甲酯酶基因插入Ti质粒上的 启动子和终止子启动子和终止子之间，确保侵染黑曲霉菌后能成功表达。为提高构建重组表达载体的成功率，在构建重组表达载体过程中加入缓冲液，其目的是 为限制酶和DNA连接酶提供适宜的pH为限制酶和DNA连接酶提供适宜的pH。
（2）获得转基因的黑曲霉后，可以通过 发酵培养发酵培养获得纯培养物，该过程需要 未改良的黑曲霉菌未改良的黑曲霉菌作为对照。为判断高产果胶甲酯酶黑曲霉工程菌是否构建成功，可对单位量的转基因黑曲霉进行发酵产酶实验，即通过检测并比较转基因黑曲霉 单位时间内催化的果胶量单位时间内催化的果胶量。因黑曲霉自身某种蛋白质的物理和化学性质与果胶甲酯酶相似，造成提取产物纯度不高，可通过 基因敲除基因敲除，避免该蛋白产生，实现获得高纯度的果胶甲酯酶。
（3）获得的黑曲霉工程菌需先进行活化和 扩大化扩大化培养后才能接种到发酵罐中进行大型发酵，以缩短发酵时间。发酵过程需保持 无菌、适宜温度、营养供给充分无菌、适宜温度、营养供给充分（至少写两点）、适宜pH、充足的氧气等条件，保证发酵过程不受杂菌污染和菌体能正常生长。
（4）发酵结束后将发酵液进行离心处理，取 上清液上清液进行果胶甲酯酶的分离和纯化工作。在分离过程中使用一定浓度的硫酸铵处理发酵液后获得有活性的果胶甲酯酶沉淀物，原因是在一定浓度的硫酸铵条件下 果胶甲酯酶溶解度低且不会破坏酶结构果胶甲酯酶溶解度低且不会破坏酶结构。
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用．
【答案】引物；启动子和终止子；为限制酶和DNA连接酶提供适宜的pH；发酵培养；未改良的黑曲霉菌；单位时间内催化的果胶量；基因敲除；扩大化；无菌、适宜温度、营养供给充分；上清液；果胶甲酯酶溶解度低且不会破坏酶结构
【解答】
【点评】
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发布：2024/4/20 14:35:0组卷：4引用：1难度：0.7
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1．人类基因组计划测定了人体的24条染色体，这24条染色体是（ ）
发布：2024/12/31 0:30:1组卷：115引用：7难度：0.7 -
2．学习以下材料，回答（1）～（4）题。
利用抑制性tRNA进行无义突变遗传病的治疗
无义突变是由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子（UAA、UAG或UGA），从而使肽链合成提前终止，造成蛋白质的功能改变，引发相关疾病。约有10%～15%的人类基因相关遗传疾病是由无义突变引发的。常规的基因治疗是将正常基因的cDNA序列或是有治疗价值的基因（如CRISPR-Cas9相关的基因编辑工具）通过一定的方式导入人体靶细胞内，达到替代或修复缺陷基因、治疗疾病的目的。导入基因插入位置不当、过高或过低表达，都可能会导致副作用。尽管基因编辑可以实现生理水平的基因表达，但基因编辑工具引入外源蛋白可能引发强烈的免疫反应仍然是巨大的挑战。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而来，它的反密码子通过碱基配对原则可以识别无义突变的终止密码子，使得mRNA在翻译至无义突变位点时不启动翻译终止而是继续向后进行翻译，获得有功能的全长蛋白。
I型黏多糖贮积症的病因，是相关基因发生无义突变，产生终止密码子UAG。研究者构建小鼠该突变基因mldua和Flag基因融合的载体（图1），以及针对该无义突变设计的sup-tRNA表达载体（产生的sup-tRNA能够识别UAG并携带酪氨酸Tyr,简写作sup-tRNATyr），将其导入细胞进行研究，发现与具有相似作用的化合物G418比较，sup--tRNA的作用更加显著（图2）；进一步利用重组腺相关病毒作为载体将sup-tRNA导入患病小鼠模型中，实验显示能够降低黏多糖过度积存，实现对该病症的有效治疗，其疗效可以持续半年以上。
从整体来看，G418在促进跨越无义突变位点继续翻译时引入的氨基酸较为随机，而sup-tRNA引入的氨基酸较为单一，且不会影响内源tRNA稳态，所以sup-tRNA在个体治疗中具有很高的安全性，因而在未来基因突变引起的疾病相关治疗中具有非常大的应用前景。
（1）侵染时，作为载体的重组腺相关病毒与靶细胞膜上的发生识别，引发内吞，进入细胞后释放单链DNA作为模板，利用宿主细胞的催化合成其互补DNA链，再经过过程产生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸较为单一，不影响内源tRNA稳态，我们还可推断，用于治疗的sup-tRNA在正常终止密码子处（填“能”或“不能”）继续往后翻译，具有很高的安全性。
（3）研究者构建mldua突变基因和Flag基因融合的载体，目的是通过检测来确定是否跨越无义突变位点继续向后翻译。实验结果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促进无义突变位点的翻译方面更加有效，支持这一结论的依据是：。
（4）有文献报道，已在近1000个不同的人类基因中发现了7500多个无义突变。常规的基因治疗需要为每种疾病设计独特的治疗策略，这将是一项耗费惊人的项目。据此说明sup-tRNA的应用价值。发布：2025/1/3 8:0:1组卷：28引用：1难度：0.6 -
3．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，自然界有些植物能产生几丁质酶催化几丁质水解从而抵抗真菌感染。通过基因工程将几丁质酶基因转入没有抗性的植物体内，可增强其抗真菌的能力。如图表示为获取几丁质酶基因而建立cDNA文库的过程。
（1）图示以mRNA为材料通过法获得cDNA，该方法依据的原理是，通过这种方法获得的基因中因缺乏和结构，导致将其直接导入受体细胞中不能复制和表达。
（2）与选用老叶相比，选用嫩叶更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（3）将从cDNA文库中获得的几丁质酶基因和质粒载体用酶和DNA连接处理后连接起来，构建基因表达载体，DNA连接酶催化形成的化学键是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：5引用：1难度：0.7
