酯酶结合荧光分析法可对有机磷和氨基甲酸酯类农药进行检测，某研究院利用转基因技术获得一种催化效率高、农药敏感性强的微生物酯酶。

（1）人工合成酯酶基因后通过PCR技术可实现扩增，为该过程提供能量的是

dNTP

dNTP

；还需要设计两种引物，设计引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的

3’端

3’端

开始连接脱氧核苷酸。为方便构建重组质粒，需要在引物的5’端设计

HindⅢ、EcoRⅠ

HindⅢ、EcoRⅠ

酶的识别序列。某质粒图谱和目的基因的序列如图所示，应选择引物

①③

①③

（填数字）。（①-④中加粗表示识别序列前的保护碱基，增强上述酶与目的基因的结合）
①5′-CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3′
②5′-CCCAAGCTTATGCTTGATATGCCAATC-3′
③5′-CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3′
④5′-CCGGAATTCCTAGTCGAACACAAGAAG-3′
（2）若提取高产酯酶野生菌的基因组DNA，用设计的引物和合适的条件进行PCR，其产物可用

电泳

电泳

鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能原因是：

在基因组DNA中有其他引物结合的位点/引物特异性不强/引物过短

在基因组DNA中有其他引物结合的位点/引物特异性不强/引物过短

。解决措施：在目的基因的

上、下游

上、下游

（填“内部”或“上、下游”）重新设计引物进行PCR。

限制酶	识别序列与切割位点	限制酶	识别序列与切割位点
PstⅠ	5′-CTGCA↓G-3′	NdeⅡ	5′-↓GATC-3′
HindⅢ	5′-A↓AGCTT-3′	EcoRⅠ	5′-G↓AATTC-3′
DpnⅡ	5′-↓GATC-3′	AluⅠ	5′-AG↓CT-3′

（3）将PCR产物和质粒用限制酶酶切，酶切产物纯化后，用

DNA连接酶

DNA连接酶

连接，连接产物导入大肠杆菌前需用

Ca²⁺（氯化钙溶液）

Ca²⁺（氯化钙溶液）

处理大肠杆菌，使其处于感受态。
（4）将目的蛋白与某些标签融合表达形成含标签的融合蛋白，实现增溶、防降解、促进分泌、便于纯化和检测等功能。6×His-Tag（组氨酸标签）含有的咪唑基团选择性地结合在已固定于层析介质的Ni²⁺、Co²⁺等金属离子上。高浓度的咪唑缓冲液可以竞争性洗脱结合在介质上的His标签蛋白。据此推测，6×His-Tag的作用之一是

便于纯化目的蛋白

便于纯化目的蛋白

。