某实验室需构建含增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因的表达载体用于科学研究。相关资料如下：
①双链DNA的每一条链有两个末端，分别是5′端和3′端，从左到右的5′-3′DNA链是编码链，从左到右的3′-5′DNA链是模板链。
②增强型绿色荧光蛋白（eGFP）在自然光下显示绿色，已知该基因的DNA编码序列如下：5′ATGGTGAGC……AAGTAA3′。
③质粒载体中含有EcoRⅠ、HindⅢ、BamHI、XbaⅠ和NotⅠ等酶的酶切位点（这些酶各自的识别序列不同），如图所示。
回答下列问题：
（1）增强型绿色荧光蛋白基因转录的mRNA碱基序列为

5’AUGGUGAGC……AAGUAA3’

5’AUGGUGAGC……AAGUAA3’

。
（2）通过PCR方法获得eGFP目的片段，首先需要设计

一对

一对

（填“一对”或“一个”）引物，在体外选择性扩增eGFP目的片段，PCR反应一般由95℃热变性、55～60℃引物和模板配对、72℃延伸三个步骤，经过多次循环完成。延伸阶段选用72℃是综合考虑了两个因素，这两个因素是

防止DNA变性

防止DNA变性

和

保存Taq酶所需温度条件

保存Taq酶所需温度条件

。
（3）eGFP的PCR产物两端分别含有BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点，构建重组表达载体时，用这两种酶酶切PCR产物和质粒载体。与单一酶酶切相比，该实验采用的双酶切方法的优点是

防止目的基因与质粒任意连接

防止目的基因与质粒任意连接

（答一点即可）。
（4）将所构建的表达载体转入大肠杆菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表达载体构建成功，可观察到多个

绿色荧光

绿色荧光

单菌落。