我国科学家将抗虫基因A、抗冻基因B导入番茄，获得了抗虫、耐寒的转基因番茄。所选用的抗虫基因A、抗冻基因B及质粒的限制酶切割位点如图所示。

（1）将抗虫基因A和质粒连接的过程需要用到的酶有

Nde I、Xba I

Nde I、Xba I

（填图中限制酶）和DNA连接酶。将抗虫基因A与质粒连接后，再将抗冻基因B连接到重组质粒上所用的限制酶是

BamH I

BamH I

。酶切后对得到的片段用去磷酸化酶处理，使末端游离的磷酸基团脱离，目的是

防止酶切片段的自身连接（或相互连接）

防止酶切片段的自身连接（或相互连接）

。
（2）多重PCR技术是在一个PCR反应体系中加入多对引物，针对多个DNA模板或同一DNA模板的不同区域，扩增多个目的基因的PCR技术。利用多重PCR技术确定转基因番茄中是否含有A、B两种基因时，体系中应加入

4

4

种引物。所加引物的设计依据是

已知目的基因的一段核苷酸序列

已知目的基因的一段核苷酸序列

，对所加引物的要求是

不同引物的核苷酸序列不同、任意两引物间不会发生碱基互补配对、引物自身不会发生碱基互补配对

不同引物的核苷酸序列不同、任意两引物间不会发生碱基互补配对、引物自身不会发生碱基互补配对

（写出两点）。