基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失，从而使部分功能被屏蔽的技术。来源于λ噬菌体的Red同源重组系统由λ噬菌体的exo、bet、gam3个基因组成，分别编码EXO、BET、GAM3种蛋白质，可用于大肠杆菌等一系列工程菌的基因敲除。Red同源重组技术要用到质粒pKD46，该质粒含有温度敏感型的复制起点oriR101，在30℃培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失；由ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，需要L-阿拉伯糖诱导表达。λ-Red系统介导的基因敲除过程如图所示。请回答下列问题：
（1）EXO为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA的末端，从5′向3′降解DNA单链，产生 3'3'（选填“3′或5′”）黏性末端；BET结合在EXO外切产生的末端单链上，促进其与受体细胞的靶序列进行同源重组，替换靶基因；GAM蛋白能够抑制受体细胞内核酸外切酶活性，进而 抑制抑制（选填“抑制”或“促进”）受体细胞对外源DNA的降解。
（2）要将pKD46导入大肠杆菌，首先需用Ca2+处理大肠杆菌，目的是 使其处于感受态使其处于感受态。为使pKD46在细菌内正常复制、Red重组酶正常合成，必需满足的培养条件是 培养温度为30℃，培养基中含L-阿拉伯糖培养温度为30℃，培养基中含L-阿拉伯糖。过程I是用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，说明 大肠杆菌不含青霉素抗性基因，pKD46中含青霉素抗性基因大肠杆菌不含青霉素抗性基因，pKD46中含青霉素抗性基因。
（3）用PCR技术扩增卡那霉素抗性基因时，同时需考虑将大肠杆菌基因组DNA上特定靶基因敲除。图中含HAⅠ的引物由两部分组成，其中HAⅠ的碱基序列应该与 靶基因外侧靶基因外侧的碱基序列相同，另一部分应该与 卡那霉素抗性基因卡那霉素抗性基因相应链上的碱基互补。
（4）为筛选出同源重组成功的大肠杆菌（靶基因被敲除），过程II使用的培养基必须含有 卡那霉素卡那霉素，然后再通过在 高于37℃高于37℃条件下培养，把质粒pKD46除去。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】3'；抑制；使其处于感受态；培养温度为30℃，培养基中含L-阿拉伯糖；大肠杆菌不含青霉素抗性基因，pKD46中含青霉素抗性基因；靶基因外侧；卡那霉素抗性基因；卡那霉素；高于37℃
【解答】
【点评】
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发布：2024/6/27 10:35:59组卷：23引用：1难度：0.7
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（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
