Gateway克隆技术是一种快速，高效地构建基因表达载体的方法。这种方法基于噬菌体可以和大肠杆菌DNA的特定位点发生互换的特点设计，不用依赖限制酶，而靠载体上存在的特定重组位点和克隆酶，将目的基因克隆到其它的受体载体上。如图1所示，Gateway克隆技术依赖于BP反应和LR反应，通过BP反应将目的基因连接到质粒1上，获得克隆质粒2，再通过LR反应将目的基因连接到载体质粒3上，获得表达载体。请回答下列问题：

（1）构建的基因表达载体除含有图示的目的基因和标记基因外，还必须有

启动子和终止子

启动子和终止子

。
（2）为构建基因表达载体，需先设计引物，通过PC特异性扩增目的基因，用于扩增目的基因的引物需满足的条件是

能与目的基因两端的碱基序列互补配对

能与目的基因两端的碱基序列互补配对

，为使PCR产物能参与后续交换，需要分别在2种引物上添加相应的attB1和attB2序列，该序列应添加在引物的

5′端

5′端

（填3′端”或5′端”）。
（3）BP反应中，将带有atB1和attB2序列的目的基因与质粒1混合，加入BP克隆酶，atB和attP位点之间会发生互换。该反应体系中可能含有未交换的质粒1和交换后的质粒2，为从体系中筛选出质粒2，用混合体系中的质粒分别转化用Ca²⁺处理后的大肠杆菌，并涂布到含有青霉素的平板上。理论上，在平板上长出菌落的大肠杆菌中含有的质粒即为质粒2，理由是

质粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因，导入该质粒的大肠杆菌能在含青霉素的平板上增殖；而质粒1含有ccdB基因，其表达的产物能抑制大肠杆菌的增殖

质粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因，导入该质粒的大肠杆菌能在含青霉素的平板上增殖；而质粒1含有ccdB基因，其表达的产物能抑制大肠杆菌的增殖

。
（4）除本题所用接种方法外，也可以采用

平板划线

平板划线

法进行接种，若培养结果如图2所示，接种环节需灼烧接种环

5

5

次。
（5）若将（3）中获得的含质粒2的大肠杆菌进行扩大培养，从物理性质考虑，一般采用

液体

液体

培养基。