In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15～20bp），然后用In-Fusion酶处理即可实现无缝连接。它的操作步骤大致为：①质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶的作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。
（1）过程①中需要用到的酶是 TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶。另外，利用 限制酶限制酶处理也可以直接得到线性化质粒。
（2）据图分析，为保证扩增出所需的目的基因，引物A或引物B要依据 目的基因和质粒目的基因和质粒的碱基序列进行设计。过程②经过 33轮循环即可初步得到符合要求的目的基因片段。
（3）过程③中，同源序列1、2的碱基排序不同，这样设计的好处是 防止目的基因反向连接；防止线性化质粒或目的基因的自身环化防止目的基因反向连接；防止线性化质粒或目的基因的自身环化。图示In-Fusion技术可作为模型使用，一般来说只需要改变图中的 引物A和引物B引物A和引物B，即可快速构建出另一种目的基因的重组质粒。
（4）若目的基因是氨苄青霉素抗性基因，以大肠杆菌作为受体细胞。为检测已转化大肠杆菌的抗性效果，在含氨苄青霉素的液体培养基中培养一段时间后，用显微镜计数法或 稀释涂布平板稀释涂布平板法进行计数，若计数结果分别是M、N，则致死率可用（M-N）/M×100%表示，通过后者来计数，此结果较真实值偏大，原因是 在用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落在用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落。
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【答案】TaqDNA聚合酶；限制酶；目的基因和质粒；3；防止目的基因反向连接；防止线性化质粒或目的基因的自身环化；引物A和引物B；稀释涂布平板；在用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落
【解答】
【点评】
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发布：2024/6/27 10:35:59组卷：17引用：2难度：0.5
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（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
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