香兰素是从香荚兰豆中提取的天然香料，因产量低而价格昂贵。近年来的生产实践中常用拟无枝酸菌生产香兰素，但香兰素在香兰素脱氢酶的作用下会进一步降 解。科研人员拟通过CRISPR-Cas9系统（由一条单链向导RNA和核酸内切酶Cas9组成），敲除拟无枝酸菌的香兰素脱氢酶基因（VDH），以提高香兰素的产量。图1是选择VDH基因中特定位点进行切割的示意图，图2是设计CRISPR-Cas9系统向导RNA中的识别序列，并构建可用于敲除VDH 基因的质粒的主要过程。请回答下列问题：
（1）核酸内切酶Cas9可催化 磷酸二酯键磷酸二酯键键的水解。利用CRISPR-Cas9系统敲除VDH基因的内部大片段属于 基因突变基因突变（变异类型）。
（2）图2中，过程A使用的4种引物序列如下：
引物 1 5'-GAGTCGAAGCTTTTTTTGAGAGCTCGTCCCACGACG-3'
引物 2 5'-GGTCGTTGATGTCCACTTCTCGTCGTCGAG-3'
引物 3 5'-AGAAGTGGACATCAACGACCAGACGGTCAAC-3'
引物 4 5'-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTTGCGAGCACCTGGAGAAGG-3'
①利用PCR1和PCR2分别扩增VDH基因的部分片段，获得VDH基因上游和下游同源臂（VDH-F和VDH-R），这两个PCR不能放在同一系统中同时进行，这是因为 引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用，导致扩增完整的VDH基因引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用，导致扩增完整的VDH基因。
②PCR3反应系统中加入的引物有 引物1和引物4引物1和引物4，此外还应加入模板DNA（VDH-F和VDH-R）、Mg2+、缓冲液、Taq酶、4种脱氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等Taq酶、4种脱氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等等，适宜条件下扩增得到VDH-F和VDH-R的融合片段。
（3）图2中，完成过程B需要加入的酶有 HindIII和DNA连接酶HindIII和DNA连接酶。将质粒2导入拟无枝酸菌前，用 Ca2+（或CaCl2）Ca2+（或CaCl2）处理使菌株处于感受态，导入后将菌液利用 稀释涂布平板（或平板划线法）稀释涂布平板（或平板划线法）法接种到添加 安普霉素安普霉素的选择培养基中，培养获得多株转化菌株。
（4）通过筛选获得的转化菌株需要从个体水平进行生产性能测试。请写出基本思路 将菌株接种到适合培养基中，置于温度等适宜条件下培养，一段时间后取样检测培养液中香兰素的浓度将菌株接种到适合培养基中，置于温度等适宜条件下培养，一段时间后取样检测培养液中香兰素的浓度。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】磷酸二酯键；基因突变；引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用，导致扩增完整的VDH基因；引物1和引物4；Taq酶、4种脱氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等；HindIII和DNA连接酶；Ca2+（或CaCl2）；稀释涂布平板（或平板划线法）；安普霉素；将菌株接种到适合培养基中，置于温度等适宜条件下培养，一段时间后取样检测培养液中香兰素的浓度
【解答】
【点评】
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发布：2024/4/20 14:35:0组卷：20引用：2难度：0.6
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（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
