糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶。大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。请回答下列问题。
（1）为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到淀粉含量 高高（填“高”或“低”）的培养基上，恒温培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈直径 较大较大（填“较大”或“较小”）的菌株，再进行复筛以及稳定性遗传实验。
（2）为获取和扩增高产糖化酶基因，研究人员提取出糖化酶高产菌株的基因组，并根据高产糖化酶基因的部分核苷酸序列设计 特异性引物特异性引物进行PCR扩增。PCR每次循环都包括变性、复性复性和延伸三步，在循环前常要进行一次94℃、5min预变性，其目的是 增加模板DNA彻底变性的概率增加模板DNA彻底变性的概率。
（3）构建高产糖化酶基因表达载体时，用限制酶EcoRⅠ和NotⅠ切割质粒pPIC9K，37℃，15min后需将温度升高至65℃并保温20min,目的是使 限制酶失活限制酶失活，从而终止酶切反应。图2是高产糖化酶基因示意图（仅示部分碱基），为使其能正确插入表达载体并成功表达，则图中A处的碱基序列应为 5′-GCGGCCGC-3′5′-GCGGCCGC-3′。
（4）毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，并且对氨苄青霉素和卡那霉素均不敏感，因此可利用 不含组氨酸不含组氨酸的基础培养基筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕赤酵母GS115（重组细胞），再将重组细胞转接至以甲醇为唯一碳源的培养液中进行发酵产酶性能测定。上述过程中，甲醇除作为碳源、提供能量外，还具有 诱导PAOX1启动，使高产糖化酶基因大量表达诱导PAOX1启动，使高产糖化酶基因大量表达的作用。
（5）为进一步揭示黑曲霉菌高产糖化酶基因突变的分子机制，研究人员将高产糖化酶基因上游表达调控序列与野生糖化酶基因同一区段的序列进行对比分析，具体差异如图3，据此推测，糖化酶基因突变可能是该序列发生了碱基（对）的 缺失和替换缺失和替换所致。
【答案】高；较大；特异性引物；复性；增加模板DNA彻底变性的概率；限制酶失活；5′-GCGGCCGC-3′；不含组氨酸；诱导PAOX1启动，使高产糖化酶基因大量表达；缺失和替换
【解答】
【点评】
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发布：2024/6/27 10:35:59组卷：43引用：2难度：0.6
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（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
