基因定点整合可替换特定基因，该技术可用于单基因遗传病的治疗。苯丙酮尿症是由PKU基因突变引起的，将正常PKU基因定点整合到PKU基因突变的小鼠胚胎干细胞的染色体DNA上，替换突变基因，可用来研究该病的基因治疗过程。定点整合的过程是：从染色体DNA上突变PKU基因两侧各选择一段DNA序列HB1和HB2，根据其碱基序列分别合成HB1和HB2，再将两者分别与基因HSV-tkl、HSV-tk2连接，中间插入正常PKU基因和标记基因neor，构建出如图所示的重组载体。重组载体和染色体DNA中的HB1和HB2序列发生交换，导致两者之间区域发生互换，如图所示。
（1）构建重组载体时，常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶限制酶、DNA连接酶。该实验用小鼠胚胎干细胞作为PKU基因的受体细胞以培育出转基因小鼠，除了胚胎干细胞能大量增殖外，还因为胚胎干细胞具有发育的全能性具有发育的全能性。
（2）为获得小鼠的胚胎干细胞，可将小鼠囊胚中的内细胞团内细胞团取出，并用胰蛋白酶或胶原蛋白酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使其分散成单个细胞进行培养，培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长，这种现象称为贴壁生长贴壁生长。
（3）用图中重组载体转化胚胎干细胞时，会出现PKU基因错误整合。错误整合时，载体的两个HSV-tk中至少会有一个与neor一起整合到染色体DNA上。已知含有neor的细胞具有G418的抗性。HSV-tkl、HSV-tk2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。转化后的胚胎干细胞依次在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是正确整合（含neor而不含HSV-tk ）正确整合（含neor而不含HSV-tk ）的胚胎干细胞，理由是能在含有G418的培养液存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor，能在含DHPG的培养液中存活说明转化后的胚胎干细胞中不含HSV-tk能在含有G418的培养液存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor，能在含DHPG的培养液中存活说明转化后的胚胎干细胞中不含HSV-tk。
（4）将筛选得到的胚胎干细胞培育成小鼠，从个体生物学水平检测，若小鼠尿液中不含大量苯丙酮酸尿液中不含大量苯丙酮酸，说明PKU基因成功表达。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】限制酶、DNA连接酶；具有发育的全能性；内细胞团；胰蛋白酶或胶原蛋白酶；贴壁生长；正确整合（含neor而不含HSV-tk ）；能在含有G418的培养液存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor，能在含DHPG的培养液中存活说明转化后的胚胎干细胞中不含HSV-tk；尿液中不含大量苯丙酮酸
【解答】
【点评】
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发布：2024/4/20 14:35:0组卷：86引用：6难度：0.6
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（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
