URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。敲除过程中利用了PCR技术，流程如图所示并回答下列问题：

（1）在PCR过程中，引物的设计是关键。除图示引物A1和B2外，还需设计引物A2和B1，才能通过步骤①和②分别获得A、B片段。引物A2和B1均由40个核苷酸组成，据图分析引物B1的5'端前20个碱基应与

C

C

互补，后20个碱基应与

B

B

互补。（填下列选项）
A．A片段的模板链
B．B片段的模板链
C．引物A2
D．引物B2
（2）在不同阶段需要添加不同引物才能获得正确的扩增产物。据图分析步骤③和④选用的引物种类（“+”代表选用，“—”代表不选用）

引物种类 步骤	引物A1	引物A2	引物B1	引物B2
①	+	+	—	—
②	—	—	+	+
③
④

（3）在引物A1、引物A2组成的反应系统中，步骤①形成A片段至少要经过

2

2

次复制。
（4）从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。
实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒实验设计思路：

将转基因酵母菌随机分为两组，一组导入含有URA3基因的重组载体，一组导入不含URA3基因的空质粒，再将两组酵母菌接种到尿嘧啶缺陷型培养基，观察生长的状况

将转基因酵母菌随机分为两组，一组导入含有URA3基因的重组载体，一组导入不含URA3基因的空质粒，再将两组酵母菌接种到尿嘧啶缺陷型培养基，观察生长的状况

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