萝卜的蛋白A具有广泛的抗植物病菌作用，而且对人体没有影响．我国科学家欲获得高效表达蛋白A的转基因大肠杆菌作为微生物农药，做了相关研究．
（1）研究者用相同的

限制酶和DNA连接

限制酶和DNA连接

酶处理蛋白A基因和pET质粒，得到重组质粒，再将重组质粒置于经

CaCl₂

CaCl₂

处理的大肠杆菌细胞悬液中，获得转基因大肠杆菌．
（2）检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌细胞中表达效率很低，研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好，因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按图2方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛋白A基因．
①这是一种定点的

基因突变

基因突变

技术．
②图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若不选用该引物则划“×”）．

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1	√ √	√ √	× ×	× ×
PCR2	× ×	× ×	√ √	√ √
PCR3	× ×	× ×	× ×	× ×
PCR4	√ √	× ×	× ×	√ √

（3）研究者进一步将含有新蛋白A基因的重组质粒和

含有蛋白A基因的重组质粒、空质粒（pET质粒）

含有蛋白A基因的重组质粒、空质粒（pET质粒）

分别导入大肠杆菌，提取培养液中的蛋白质，用

抗原-抗体杂交

抗原-抗体杂交

方法检测并比较三组受体菌蛋白A的表达产物，判断新蛋白A基因表达效率是否提高．为检测表达产物的生物活性，研究者将上述各组表达产物加入到长满了植物病菌的培养基上，培养一段时间后，比较

抑菌圈

抑菌圈

的大小，以确定表达产物的生物活性大小．
（4）作为微生物农药，使用时常喷洒蛋白A基因的发酵产物而不是转蛋白A基因的大肠杆菌，其优点是

对人、畜、农作物和自然环境安全；不会造成基因污染；有效成分纯度较高

对人、畜、农作物和自然环境安全；不会造成基因污染；有效成分纯度较高

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