科学家卡彭蒂娜和杜德娜发现，细菌中存在清除入侵病毒 DNA 的功能系统，并发明了 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，因此获得 2020 年诺贝尔化学奖。该系统主要包含向导 RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白两部分，sgRNA 能特异性识别结合特定的 DNA 序列，从而引导 Cas9 蛋白到相应位置剪切 DNA，最终实现对靶基因序列定点编辑，其工作原理如图 1所示。科研人员通过诱变得到丧失剪接功能的 dCas9，并建构 CRISPR/dCas9 系统，保留了sgRNA引导进入基因组的能力；dCas9 与 VP64、P65 等转录激活因子融合，形成的 dCas9-SAM 可用于基因调控等研究。
（1）CRISPR/Cas9系统能精准识别相关基因，依据的原理是 sgRNA与目标DNA 发生 碱基互补配对碱基互补配对；Cas9 蛋白可催化 磷酸二酯键磷酸二酯键（填化学键名称）水解，剪切特定 DNA 片段。CRISPR/Cas9 系统广泛存在于细菌等原核生物中的生理意义是 防止外源基因插入和表达，保证原核生物自身安全和遗传稳定防止外源基因插入和表达，保证原核生物自身安全和遗传稳定。
（2）将 OCT4、KLF4、MYC及SOX2 四个基因的 sgRNA 序列串联成的sgRNA质粒和 dCas9-SAM质粒与磷脂等混合，形成包埋 DNA 脂质体，将脂质体加入细胞系 MCF7的细胞培养皿中，即可将外源 DNA 导入细胞中。24h后通过添加 抗生素G418和嘌呤霉素抗生素G418和嘌呤霉素筛选并进行单细胞培养即可得到基因编辑后的细胞。此过程须在37℃，气体环境为 95%空气加5%CO2的混合气体95%空气加5%CO2的混合气体的细胞培养箱中进行。该实验通过4种 sgRNA 对 MCF7 细胞进行基因编辑，可实现多基因 同时调控（或表达）同时调控（或表达）的目的。
（3）实验发现，CRISRP/Cas9 基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶“，sgRNA 的序列长短影响成功率，序列越短，脱靶率越高。分析脱靶最可能的原因：非基因编辑对象也可能含有与sgRNA配对的碱基序列，造成sgRNA选错对象与之错误结合而脱靶非基因编辑对象也可能含有与sgRNA配对的碱基序列，造成sgRNA选错对象与之错误结合而脱靶。
（4）为了获得某水稻品种的不育系，研究人员利用 Cas9 蛋白对该品种的 TMS5 基因进行编辑。首先从水稻组织中提取总RNA，经逆转录获得总 cDNA，然后通过PCR技术可准确扩增出 TMS5 基因，原因是 加入的特定引物能与总cDNA中TMSS基因特异性结合加入的特定引物能与总cDNA中TMSS基因特异性结合。在筛选出成功导入 TMS5 基因表达载体的水稻愈伤组织后，经多代培养仍能提取出TMS5 基因，你认为 TMS5 基因是否已成功转化？说明你的观点及理由：不一定，转化是指目的基因成功导入受体细胞并稳定存在和表达，仅提取到TMS5基因不能说明它能否正常表达不一定，转化是指目的基因成功导入受体细胞并稳定存在和表达，仅提取到TMS5基因不能说明它能否正常表达。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】碱基互补配对；磷酸二酯键；防止外源基因插入和表达，保证原核生物自身安全和遗传稳定；抗生素G418和嘌呤霉素；95%空气加5%CO2的混合气体；同时调控（或表达）；非基因编辑对象也可能含有与sgRNA配对的碱基序列，造成sgRNA选错对象与之错误结合而脱靶；加入的特定引物能与总cDNA中TMSS基因特异性结合；不一定，转化是指目的基因成功导入受体细胞并稳定存在和表达，仅提取到TMS5基因不能说明它能否正常表达
【解答】
【点评】
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发布：2024/4/20 14:35:0组卷：23引用：3难度：0.7
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3．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
