Cre/loxP酶系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，可以在DNA的特定位点上执行碱基序列的删除、插入以及重组等，从而实现基因的定点编辑。

（1）图1是利用Cre/loxP酶系统敲除基因的过程。loxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成。当某一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向loxP序列时，Cre酶识别并结合到loxP序列的反向重复序列区。两个loxP序列的间隔序列被Cre酶定点切开，4个黏性末端序列交错两两连接，其中待敲除基因两端的序列进行连接，连接时形成的化学键是

磷酸二酯键

磷酸二酯键

，敲除的基因片段会形成

环状

环状

（填“线状”或“环状”）结构。
（2）图2是利用Cre/loxP酶系统构建融合基因的过程。首先要用PCR对Bt基因和Bar基因分别扩增，以获得所需要的DNA片段，然后对连接后的DNA片段用Cre/loxP酶系统处理获得Bt-Bar融合基因片段。在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置在

Bt的两种引物分别在启动子外侧和终止子内侧

Bt的两种引物分别在启动子外侧和终止子内侧

；又有研究表明，大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG。由此推测，对Bar基因引物5′端序列的要求是

引物的5'端均要连接上loxP序列，并在末端加上保护碱基序列（GGG）

引物的5'端均要连接上loxP序列，并在末端加上保护碱基序列（GGG）

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（3）图3是用Cre/loxP酶系统敲除转基因烟草细胞内Bar基因的部分过程。已知图中的启动子和终止子可在烟草细胞中正常发挥作用，Cre酶基因在环境中存在Tam化学物质时才能激活表达。重组Ti质粒中的Bar基因作为基因表达载体中的

标记基因

标记基因

可对转化后的烟草细胞进行筛选。进行图3所示敲除后，DNA片段1中的Bt基因不能正确表达，据图分析，原因是

缺少Bar的终止子

缺少Bar的终止子

；若不对融合基因中的Bar基因进行敲除处理，仅在翻译水平上不让Bar基因表达，请利用Cre/loxP酶系统提出解决方案

利用Cre/loxP酶系统在Bt基因和Bar基因之间插入终止密码子对应的DNA序列

利用Cre/loxP酶系统在Bt基因和Bar基因之间插入终止密码子对应的DNA序列

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（4）图4是经过修饰后的转基因烟草细胞内的融合基因所在片段及相关引物的结合位点。为检测Bar基因是否被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，可用PCR技术进行鉴定：
实验组：首先提取在有Tam环境下培养的转基因烟草细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入引物1和引物2进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无Bt基因和Bar基因的条带。
对照组：用未进行敲除处理的转基因烟草细胞，其余同实验组。
若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为

实验组没有条带，对照组有一条bt-bar融合基因条带

实验组没有条带，对照组有一条bt-bar融合基因条带

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