芽孢杆菌生长迅速，营养要求简单，且能形成抗逆性很强的芽孢。某实验小组欲以黄瓜灰霉病菌作为指示菌，从采集到的土样中分离芽孢杆菌，并从分离到的芽孢杆菌中筛选高效广谱拮抗菌（指一种菌能产生某种物质抑制另外一种菌的生存），其所需培养基和实验步骤如下。回答下列问题：
（一）培养基
PB培养基：用于病原细菌的培养和病原细菌拮抗菌的培养、筛选及保存。
PDA培养基：用于病原真菌的培养和病原真菌拮抗菌的筛选。
（二）实验步骤
（1）芽孢杆菌的分离和纯化
准确称取10g土壤样品，加入到盛有90 mL的无菌水中，振荡静止后再用

无菌移液器

无菌移液器

吸取10mL土壤悬液加到90 mL无菌水中，充分混匀，即得

10²

10²

倍稀释液，然后以此类推逐步梯度稀释至适当浓度，取合适稀释度下的菌液，涂布接种于

PB

PB

固体培养基上。根据菌落的

大小、形状、质地、颜色、光泽、透明度

大小、形状、质地、颜色、光泽、透明度

（答三个）等特征，挑取不同形态的单菌落，作为待测原始菌株。
（2）拮抗菌的初筛--五点对峙法
在PDA平板中心接种黄瓜灰霉病菌菌饼，四周等距离接种待筛选芽孢杆菌，25℃恒温培养，每个筛选实验重复3次，目的是

避免实验的偶然性，使实验结果更可靠

避免实验的偶然性，使实验结果更可靠

。根据

各筛选菌产生的抑菌圈大小

各筛选菌产生的抑菌圈大小

比较拮抗能力，从而保留拮抗效果优良的菌株。
（3）探究培养时间对抗菌物质的影响
实验小组通过筛选找出了优良的芽孢杆菌菌株ch-22，现欲探究培养时间对其产生的抗菌物质活性的影响，请简要写出实验思路：

取适量菌株ch-22接种于一定量的富集培养液巾，适宜条件下，分别培养不同时间（24h、36h、48h、60h、72h、84h……）后，取发酵液过滤除菌，采用“五点对峙法”检测不同时间等量培养液中抗菌物质的抑菌效果（培养时间可改变）

取适量菌株ch-22接种于一定量的富集培养液巾，适宜条件下，分别培养不同时间（24h、36h、48h、60h、72h、84h……）后，取发酵液过滤除菌，采用“五点对峙法”检测不同时间等量培养液中抗菌物质的抑菌效果（培养时间可改变）

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