基因组中大片段DNA的定向整合拥有广阔的应用前景，目前细菌中的定向整合系统存在诸多不足，如效率偏低，缺乏有效的筛选标记物，可整合的片段大小有限（3～4kb）等。研究者尝试构建CRISPR RNA-guided定向整合系统以改善上述缺陷。
（1）Cas蛋白是一种RNA引导的内切酶，能催化双链DNA在特定位点断裂。crRNA是一种短链RNA，它一端可与Cas蛋白结合，另一端通过 碱基互补配对碱基互补配对原则与目标DNA序列结合。
（2）转座子（Tn）是一段特殊的DNA片段。转座酶A和转座酶B相互结合后可将Tn从原有的DNA链上切下，并将其整合到其他DNA片段上。为了使转座子定向整合到特定的位置，研究者构建了图1所示的CRISPR RNA-guided定向整合系统，导入大肠杆菌，并统计定向整合的效率，结果如图2。
①构建重组质粒时，应将翻译终止序列设置在Cas基因和转座酶A基因之后而不是设置在两者之间，目的是 让Cas蛋白和转座酶A形成融合蛋白，便于Cas蛋白引导转座酶定位到crRNA所结合的DNA附近，实现转座子的定向整合让Cas蛋白和转座酶A形成融合蛋白，便于Cas蛋白引导转座酶定位到crRNA所结合的DNA附近，实现转座子的定向整合。
②由图2结果可知，转座子的定向整合效率高低与 转座子整合的方向转座子整合的方向密切相关。为保证转座子连接方向与预期相同，构建重组质粒的过程中，对切割转座子和切割载体的限制酶的要求是 利用两种不同的限制酶切割转座子和载体，且保证黏性末端的连接方向与预期相同利用两种不同的限制酶切割转座子和载体，且保证黏性末端的连接方向与预期相同。
③由图2结果可知，该系统还能有效解决筛选标记物缺乏的问题，理由是 RL方向的定向整合效率接近100%，无需再用标记物进行筛选RL方向的定向整合效率接近100%，无需再用标记物进行筛选。
（3）研究者替换了不同长度的转座子，继续检测定向整合效率，结果如图3。
与现有的定向整合系统相比，CRISPR RNA-guided定向整合系统可整合的片段大小得到提高，判断依据是 当转座子长度大于3～4kb时，定向整合效率依然接近100%当转座子长度大于3～4kb时，定向整合效率依然接近100%。
（4）利用该系统能实现基因定向整合的特点，举例说出其在科学研究中还可以有哪些应用：将转座子插入特定基因，破坏该基因的结构，形成基因缺陷突变体，用以研究该基因的功能将转座子插入特定基因，破坏该基因的结构，形成基因缺陷突变体，用以研究该基因的功能。（举出一例即可）
【答案】碱基互补配对；让Cas蛋白和转座酶A形成融合蛋白，便于Cas蛋白引导转座酶定位到crRNA所结合的DNA附近，实现转座子的定向整合；转座子整合的方向；利用两种不同的限制酶切割转座子和载体，且保证黏性末端的连接方向与预期相同；RL方向的定向整合效率接近100%，无需再用标记物进行筛选；当转座子长度大于3～4kb时，定向整合效率依然接近100%；将转座子插入特定基因，破坏该基因的结构，形成基因缺陷突变体，用以研究该基因的功能
【解答】
【点评】
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发布：2024/4/20 14:35:0组卷：11引用：2难度：0.7
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