拟南芥是植物遗传学研究上重要的模式生物。在研究与维管发育相关的基因时，研究人员筛选到一花发育明显变异的拟南芥突变体ET139。为了探明该表型变异是否由Ds转座突变（Ds为插入基因组的一段特定序列）所造成，需要对Ds插入的DNA序列进行分析。交错式热不对称PCR（TAIL-PCR）技术，可用于分离与已知序列邻近的未知DNA序列。研究人员利用该方法 对拟南芥突变体ET139进行分析，方法步骤如下：
（1）获取模板：提取叶片的

基因组DNA

基因组DNA

，作为扩增未知侧翼序列的模板。
（2）引物设计：TAIL-PCR使用一套嵌套的序列特异引物（SP）和随机简并引物（AD）组合，进行“半特异性PCR反应”。本实验中，特异性引物根据

Ds

Ds

序列设计，在其

5’和3’

5’和3’

端设计多个嵌套的引物SP；而随机简并引物AD是较短的混合序列组合。
（3）PCR反应体系和反应条件：

反应	反应体系		循环设置	循环数
第1轮	水、缓冲液、SP1、AD、 dNTP dNTP 、 Taq酶 Taq酶 、模板	1 2 3	94℃1 min 94℃30 s,62℃1 min,72℃1 min 30 s 94℃30 s,25℃3 min,0.3℃/s→72℃，72℃ 2 min 30 s, 94℃30 s,68℃1min,72℃2 min 30 s, 94℃10 s,68℃1 min,72℃2 min 30 s, 94℃30 s,44℃1 min,72℃2 min 30 s 72℃5 min,4℃保持	1 5 15
第2轮	第1轮产物为模板、SP2、AD、其余同上	1 2	94℃30 s,64℃1 min,72℃2 min 30s, 94℃30 s,64℃1 min,72℃2 min30 s, 94℃30 s,44℃1 min,72℃2 min 30 s 72℃5 min,4℃保持	12
第3轮	第2轮产物为模板、SP3、AD、其余同上	1 2	94℃1 min,44℃1 min,72℃2 min 30 s 4℃保持	20

（4）产物的回收与测序：TAIL-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，对特异条带回收并测序。将测序结果序列经过数据库与拟南芥

基因组

基因组

（填“基因组”或“cDNA”）进行比对。
（5）结果和分析：TAIL-PCR是利用引物特异性和长短的差异，设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物，消除非目标产物。特异性引物SP退火温度比随机引物AD退火温度

高

高

（填“高”或“低”），退火在不同温度下进行，则二个引物或者其中一个

SP

SP

能够很好地起作用。TAIL-PCR理想的电泳结果应该是第3轮产物大于300bp且比第2轮产物略

小

小

（填“大”或“小”）；产物中可能会出现多条带，但一般仅有一条最亮。
本实验在阳性克隆测序后获得了大小不同的侧翼序列，其结果一致，检测出的侧翼序列为At1g52910基因序列，正常表型的突变体与异常表型的突变体均插入同样的位点，并且没有发现其它插入位点。

（At1g52910由3个外显子和2个内含子组成，Ds插入位点在第2外显子处）
（6）讨论：由以上TAIL-PCR对突变体 ET139检测结果推测，突变纯合体出现花器官的变异表型，是否由Ds的插入而产生？

不是

不是

，原因是

因为正常表型的突变体与异常表型的突变体均有Ds插入同样的位点，且没有发现其它插入位点

因为正常表型的突变体与异常表型的突变体均有Ds插入同样的位点，且没有发现其它插入位点

。