维生素C既是人与动物必需的营养成分，并有抗氧化作用而广泛应用于食品工业。中国科技工作者发明的维生素C“二步发酵法”生产工艺是世界首创：第一步发酵用醋酸杆菌为菌种，第二步发酵用氧化葡萄糖酸杆菌（“小菌”）和假单胞杆菌（“大菌”）混合菌种。如图为二步发酵法的生产流程，请回答有关问题：

（1）为纯化和保存菌种，将一步发酵液抽样稀释用

涂布

涂布

法接种含有碳酸钙粉的培养基上，以

C

C

（填下列选项代号）为最佳指标，分离保存菌种。
A.菌落直径大小
B.溶钙圈大小
C.溶钙圈直径与菌落直径比值
（2）对一步发酵培养液检测发现几乎没有杂菌存在，请推测可能的原因是

培养液呈酸性抑制杂菌的生长

培养液呈酸性抑制杂菌的生长

。
（3）二步发酵过程中大小菌的菌种数比例会影响产酸率，种液接入发酵罐前衢对种液中的大小菌计数。计数所用的培养基除含有与发酵液相同的成分外，还需添加

琼脂

琼脂

，根据菌落的

大小、颜色、形状或隆起程度

大小、颜色、形状或隆起程度

对培养波中的大小菌分别计数。现某检测员将种液稀释接种了3个平板，统计假单胞杆菌的菌落数分别是30、100 和200，取平均值110。该结果可信度低，原因是

数据值间差距太大，重复性差

数据值间差距太大，重复性差

。
（4）若要尝试固定化混合菌进行二步发酵来生产古龙酸，你认为固定化混合菌操作时要注意哪些方面？

大小菌的混合比例、避免包埋方法对菌种活性影响、避免包埋时混入杂菌等

大小菌的混合比例、避免包埋方法对菌种活性影响、避免包埋时混入杂菌等

（至少提出两点）。