铜绿假单胞菌常常引起禽类、水貂等发生败血症及呼吸系统感染等疾病，给养殖业带来严重损失。科研人员尝试克隆和表达该菌外膜蛋白oprD基因，以用于后期的疫苗研制工作。相关限制酶识别序列及用于构建基因表达载体的质粒图示如下，其中Amp“表示氨苄青霉素抗性基因，请回答下列问题：

限制酶	识别序列
BamHI	5'G↓GATCC3'
EcoRI	5'G↓A ATTC3'
Not I	5'GC↓GGCCGC3
XhoI	5'C↓TCGAG3'

（1）质粒的基本单位是

脱氧核苷酸

脱氧核苷酸

，一个质粒分子中通常含

0

0

个游离的磷酸基团。Amp基因常作为基因工程中的标记基因，标记基因的作用是

供重组DNA的鉴定与选择

供重组DNA的鉴定与选择

。
（2）若已知铜绿假单胞菌的oprD基因序列，可利用

PCR

PCR

技术快速大量扩增该基因。为便于扩增的oprD基因与表达载体的连接，在设计引物时，常在两条引物的

5′

5′

端加上限制酶的识别序列，设计后的引物如下：
引物1：5'-CGGGATCCATGAAAGTGATGAAGTGG-3'；
引物2：5'-CCCTCGAGTTACAGGATCGACAGCGG-3'。
（3）根据上题中的引物信息分析，在构建oprD基因表达载体时，可选择

BamHⅠ

BamHⅠ

和

XhoⅠ

XhoⅠ

两种不同的限制酶同时切割目的基因和质粒，以提高目的基因和质粒的重组效率。
（4）将目的基因导入大肠杆菌时，一般先用Ca²⁺溶液处理大肠杆菌，使细胞处于

能吸收周围DNA分子

能吸收周围DNA分子

的生理状态即感受态。