COR基因是植物的冷调节基因，其编码的亲水性多肽能保护细胞免受冻害，具有增强植物抗寒性的作用。转录因子CBF（由CBF基因控制合成）能够特异性结合下游靶基因启动子区，从而激活COR基因的表达以提高植物的抗寒性。将不同植物中获取的CBF基因和COR基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体，转入植物体内能有效提高植物的低温耐受性。构建基因表达载体时需要根据载体和目的基因上的限制酶切割位点选择不同的限制酶，当遇到平末端和黏性末端不能连接时，可利用限制酶Klenow酶特有的5'→3'DNA聚合酶活性，将黏性末端补平后再与平末端连接。
（1）研究小组获取了一段包含CBF基因的长DNA片段，根据已知CBF基因序列设计了适宜长度的引物A和引物B，则在PCR反应过程中需要经过

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次复制才会出现与CBF基因长度和序列完全吻合的产物；经过四次循环形成的产物中同时含有A引物和B引物的DNA占

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。
（2）抗寒相关基因超量表达依赖于适宜的启动子。启动子可分为组成型启动子（每种组织器官中均发挥作用）、组织特异型启动子（特定组织器官中才能发挥作用）和诱导型启动子（特定条件刺激才能发挥作用），构建基因表达载体时可单独使用某一类型的启动子也可多种类型组合使用。从减少物质和能量消耗的角度出发，最好选择

块茎组织特异型启动子和冷刺激诱导

块茎组织特异型启动子和冷刺激诱导

类型启动子使马铃薯块茎在寒冷刺激下才启动抗寒基因的表达。
（3）为将COR基因表达载体和CBF基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体，应选择不同的限制酶分别切割COR基因表达载体和CBF基因的两端，目的是

保证COR基因表达载体和CBF基因的正确连接（避免CBF基因和COR基因表达载体的自身环化以及CBF基因的反向连接）

保证COR基因表达载体和CBF基因的正确连接（避免CBF基因和COR基因表达载体的自身环化以及CBF基因的反向连接）

。根据下图所示限制酶切割位，点和识别序列，实验室中构建抗寒基因超量表达载体时，为实现经Xbal切割后的CBF基因与COR基因表达载体的连接，应选用的限制酶是

SamI、Klenow酶

SamI、Klenow酶

。

（4）转录因子CBF特异性识别下游靶基因启动子区后，可能与

RNA聚合

RNA聚合

酶结合形成复合体从而激活COR基因的表达。
（5）科学家成功培育出抗寒基因超量表达的转基因植物后，筛选到一个AtNUP160基因突变的植株（atnup160突变体），已知AtNUP160基因表达产物能通过参与核孔复合体的形成影响RNA的出核转运，在植物抗寒过程中发挥重要的作用。研究发现，atnup160突变体中CBF基因的表达水平降低，进而影响了COR基因的表达，植物抗寒能力减弱。由此推断atnup160突变体抗寒能力减弱的机理是

atnup160突变体中AtNUP160基因表达产物减少，影响核孔复合体的形成，导致CBF基因转录形成的mRNA无法转运出核，转录因子CBF减少，使得COR基因的表达水平明显降低，产生保护细胞免受冻害的亲水性多肽减少，植物抗寒能力减弱

atnup160突变体中AtNUP160基因表达产物减少，影响核孔复合体的形成，导致CBF基因转录形成的mRNA无法转运出核，转录因子CBF减少，使得COR基因的表达水平明显降低，产生保护细胞免受冻害的亲水性多肽减少，植物抗寒能力减弱

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