产黄青霉是青霉素工业生产的常用菌，利用诱变育种和基因工程育种方法获得高产菌并进行发酵生产。回答下列问题：
（一）菌种的选育及保存。
（二）发酵过程及产物分离纯化。发酵流程为：活化培养→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐（发酵）→放罐。
（1）诱变育种。在山梨醇溶液中用酶水解产黄青霉细胞壁，得到原生质体，推测山梨醇溶液的作用是

维持渗透压，防止原生质体被破坏

维持渗透压，防止原生质体被破坏

。用15W的紫外线在距离培养瓶20cm处照射产黄青霉原生质体，诱发其发生变异。为检测是否发生变异，可利用显微镜观察其细胞核中染色体

结构和数目

结构和数目

变化，也可以接种到固体培养基上，经培养后观察

菌落形态

菌落形态

变化。
（2）基因工程育种。
①将产黄青霉涂布于三种抗生素的一系列不同浓度的平板上，在26℃培养箱中培养12小时，研究菌落生长情况。结果发现，四环素浓度达250μL/mL，菌落数开始减少，氯霉素浓度高达500μL/mL，菌落仍然能正常生长，10μL/mL腐草霉素足以抑制菌落生长。据此推测，应该选用

腐草霉素抗性

腐草霉素抗性

基因作为筛选标记基因。
②获得促进产黄青霉大量合成青霉素的目的基因，经PCR扩增后，连接到真菌表达载体上，真菌表达载体上除了有标记基因、复制起点还有

启动子和终止子

启动子和终止子

，使目的基因得以表达。
③利用PEG介导的原生质体转化法将表达载体导入产黄青霉原生质体。影响转化效率的因素除表达载体的大小和数量、PEG浓度及外界因素外，还有

原生质体数量、原生质体生理状态、PEC作用时间

原生质体数量、原生质体生理状态、PEC作用时间

等（写出2点）。
（3）菌种保存。以上两种方法筛选得到的高产菌，一般通过制备繁殖体孢子，利用真空干燥，低温长期保存。采用孢子保存而不直接保存菌丝的原因是

孢子处于休眠状态，不易突变

孢子处于休眠状态，不易突变

。
（4）发酵条件的控制：产黄青霉菌丝生长温度为27℃左右，分泌青霉素温度为20℃左右。所以种子罐的温度一般要比发酵罐的

高

高

。产黄青霉培养基的pH应控制为

中性偏酸

中性偏酸

，增加培养基中溶氧量的方法有控制通入无菌空气的速度和控制

搅拌

搅拌

速度。发酵过程会产生泡沫，需要用消沫剂除去泡沫，以提高发酵效率。下列哪些因素会使发酵液产生的泡沫增多？

ABCD

ABCD

。
A．发酵菌细胞呼吸产气增多
B．加速搅拌发酵液
C．通气增多
D．培养基黏度高
（5）产物的分离纯化：发酵过程结束后，可通过

离心或过滤

离心或过滤

得到发酵液，加少量絮凝剂沉淀蛋白后，根据青霉素易溶于有机溶剂的特性，可采用

萃取

萃取

的方法进一步分离纯化。