大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的蛋白质。传统的制备凝乳酶的方法是通过杀死未断奶的小牛，然后将它的第四胃的黏膜取出来进行提取，此法已不再使用。现在科学家将编码牛凝乳酶的基因（长度1.5 kb）导入大肠杆菌获得工程菌，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。图1为所用载体示意图，表为限制酶的识别序列及切割位点。请回答下列问题：

限制酶	识别序列
HindⅡ	A↓AGCTT
Pvit2	CAG↓CTG
KpnⅠ	G↓GTACC
EcoRⅠ	G↓AATTC
PstⅠ	CTGC↓AG
BamHⅠ	G↓GATCC

（1）获取牛凝乳酶基因：提取小牛胃黏膜组织中的

总RNA

总RNA

，经逆转录得到

cDNA

cDNA

，将其作为PCR反应的模板，并依据

牛凝乳酶基因两端的核苷酸序列

牛凝乳酶基因两端的核苷酸序列

，设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）构建基因表达载体：为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的

5′

5′

端分别引入

Pvit2和EcoRⅠ

Pvit2和EcoRⅠ

两种不同限制酶的识别序列。在目的基因和载体连接时，可选用

T₄DNA连接酶

T₄DNA连接酶

（填“E.coli DNA连接酶”或“T₄ DNA连接酶”）。
（3）转化：先用

CaCl₂（Ca²⁺）

CaCl₂（Ca²⁺）

溶液处理大肠杆菌细胞，使其处于

感受态

感受态

的生理状态，以提高转化效率。
（4）筛选与鉴定：将转化后的大肠杆菌接种在含

氨苄青霉素

氨苄青霉素

的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，

2

2

号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图2中。
（5）发酵工程生产凝乳酶：发酵工程需要对选育的工程菌菌种进行扩大培养，从物理性质上，一般选

液体

液体

培养基进行培养。发酵过程的中心环节是

（发酵罐）发酵

（发酵罐）发酵

，必须严格控制好发酵条件，以便获得更多的发酵产品。