（四）基因敲除与斑马鱼
CRISPR/Cas9系统由单链的向导RNA（gRNA）和核酸内切酶Cas9构成，可以定向切割DNA敲除基因，最早在细菌中发现，目前被广泛用于哺乳动物的基因编辑。科研人员为高效获得特定基因敲除的斑马鱼系，对Cas9基因序列进行了优化改造的研究。
（1）CRISPR/Cas9系统中，组成gRNA和Cas9蛋白的基本单位分别是

核糖核苷酸和氨基酸

核糖核苷酸和氨基酸

。
（2）研究人员发现，不同物种的细胞会“偏爱“使用一种密码子决定特定的氨基酸。为了让细菌的Cas9基因序列在斑马鱼中更好的表达，需要对Cas9基因序列进行优化改造。以下说法合理的是

ABD

ABD

。（多选）
A.大多数氨基酸对应不止一个密码子是优化改造的重要依据
B.基因组序列分析可以推测出不同物种的细胞对密码子的偏好性
C.优化改造前后Cas9基因转录出的Cas9mRNA不变
D.优化改造前后Cas9基因表达的Cas9蛋白结构不变
（3）研究人员发现，Cas9基因优化改造后表达效率显著提升，但产生的Cas9蛋白无法在斑马鱼中发挥作用。若在Cas9基因两端添加编码核定位短肽的DNA序列（NLS）即可解决问题，如图1，据此推测，NLS添加前后Cas9蛋白作用情况不同的原因是

NLS添加前，来自细菌的Cas9蛋白不能进入斑马鱼（真核）细胞的细胞核，NLS添加后，可以表达产生核定位短肽，引导Cas9蛋白（通过斑马鱼细胞核的核孔）进入斑马鱼细胞的细胞核发挥作用（定向切割DNA）

NLS添加前，来自细菌的Cas9蛋白不能进入斑马鱼（真核）细胞的细胞核，NLS添加后，可以表达产生核定位短肽，引导Cas9蛋白（通过斑马鱼细胞核的核孔）进入斑马鱼细胞的细胞核发挥作用（定向切割DNA）

。

（4）gRNA能引导Cas9蛋白到DNA的特定基因位点进行切割。研究人员用化学方法合成特定的gRNA，与Cas9mRNA一起注射到斑马鱼细胞，筛选出特定基因敲除的斑马鱼。下列叙述正确的是

B

B

。
A.两种RNA通过显微注射法导入斑马鱼的卵细胞
B.gRNA通过碱基互补配对实现引导功能
C.Cas9mRNA能对基因位点进行切割
D.基因敲除后的斑马鱼一定发育异常
研究人员利用CRISPR/Cas9系统获得了1种P2yl2基因敲除的斑马鱼突变体，发现其原始造血系
统受到了影响。经测序，野生型和突变型在基因敲除部位的序列如图2。

（5）根据图2和所学知识，分析P2yl2基因敲除对斑马鱼原始造血系统产生影响的机制：

突变体的P2y12基因发生了碱基对的替换和碱基对的缺失，导致其表达产生的蛋白质空间结构（氨基酸种类、氨基酸数目、氨基酸序列、肽链长度等）改变，从而失去正常功能，对斑马鱼的原始造血系统造成了影响

突变体的P2y12基因发生了碱基对的替换和碱基对的缺失，导致其表达产生的蛋白质空间结构（氨基酸种类、氨基酸数目、氨基酸序列、肽链长度等）改变，从而失去正常功能，对斑马鱼的原始造血系统造成了影响

。