某种地中海贫血（TDT）是严重的单基因病，严重时可能危及生命。人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对TDT患者实行基因治疗。研究人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，可以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。分析回答：
（1）图中启动子是 RNA聚合酶RNA聚合酶识别和结合位点，绿色荧光蛋白基因作为 标记基因标记基因。
（2）PCR扩增γ基因上游不同DNA片段的原理是 DNA双链复制DNA双链复制，为使PCR反应体系中的模板解链为单链，需要满足的条件是 加热（至90-95℃）加热（至90-95℃）。
（3）将扩增后的产物定向插入载体指导绿色荧光蛋白基因表达，需要在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在R末端添加的序列所对应的限制酶应为 EcoRⅠEcoRⅠ。实验中R等引物的作用是 使DNA聚合酶（Taq酶）从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸使DNA聚合酶（Taq酶）从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（4）从产物扩增到载体构建完成的整个过程中，除限制酶外，还必须用到的工具酶有DNA连接酶和 耐热的DNA聚合酶耐热的DNA聚合酶，其中前者催化形成的化学键是 磷酸二酯键磷酸二酯键。
（5）将构建好的载体成功转化至除去BCL11A基因的受体细胞中，结果发现，含F1～F6与R扩增产物的受体细胞发出绿色荧光。向培养液中添加适量的雄激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞荧光消失，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游的调控序列上与引物所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于 引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】RNA聚合酶；标记基因；DNA双链复制；加热（至90-95℃）；EcoRⅠ；使DNA聚合酶（Taq酶）从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸；耐热的DNA聚合酶；磷酸二酯键；引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
【解答】
【点评】
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发布：2024/6/27 10:35:59组卷：17引用：4难度：0.6
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