黄瓜花叶病毒能感染多种植物，对烟草的危害尤其严重。病毒的Cu-4基因表达所形成的蛋白是子代病毒形成和释放的关键蛋白，研究人员利用农杆菌转化法获得能表达Cu-4基因反义RNA的转基因烟草，反义RNA与Cu-4基因转录获得的mRNA互补结合形成双链RNA，阻止了mRNA的翻译，从而获得了抵抗该病毒的能力。在Cu-4基因（A链是模板链）一侧连接了带有细菌启动子的四环素抗性基因（在植物细胞该基因会被完整切除），如图1所示。图2是Ti质粒相关基因图谱。
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备注：
1.Cu-4基因长度为300bp,tet^r基因长度为500bp。Ⅰ—Ⅳ是四种引物。
2.LB和RB是T-DNA的边界，XhoⅠ和EcoRⅠ是两种限制酶，切割后形成的黏性末端不互补。P_3ss和T_RBC是仅在植物细胞中发挥功能的启动子和终止子。tet^r和amp^r分别是四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。所用农杆菌不具有氨苄青霉素、四环素和潮霉素抗性。
（1）人工合成如图1所示的DNA片段后，利用引物组合

B

B

（A.引物Ⅰ和Ⅳ；B.引物Ⅱ和Ⅲ；C.引物Ⅰ和Ⅲ；D.引物Ⅱ和Ⅳ）进行PCR扩增，为使图1所示的DNA片段能与载体正确连接，在引物的5′端分别添加

XhoⅠ和EcoRⅠ

XhoⅠ和EcoRⅠ

酶的识别序列。将Ti质粒导入农杆菌后，可使用含有

四环素

四环素

的培养基进行筛选。
（2）在将农杆菌接种在烟草叶片前用砂纸轻微摩擦烟草叶片，目的是

增加叶片伤口数量，提高农杆菌侵染成功率

增加叶片伤口数量，提高农杆菌侵染成功率

。接种一段时间后，将烟草叶片酶解，获取分散的叶肉细胞。将叶肉细胞培养在含有潮霉素的培养基中扩增培养，其中潮霉素的作用是

去除农杆菌

去除农杆菌

。
（3）提取叶肉细胞的总DNA，酶切后用相应的PCR引物进行扩增，电泳后若观察到长度

300bp

300bp

的片段，则说明所需的基因导入植物细胞中。
（4）将具有黄瓜花叶病毒抗性的烟草进行自然种植时，需考虑转基因作物带来的

安全性

安全性

问题。研究人员发现将目的基因转移到植物细胞线粒体或叶绿体中可降低基因漂移发生的风险，原理是

基因漂变常通过传粉过程进行，而受精过程中，雄配子只有细胞核基因传递给了下一代，细胞质基因并未传给下一代（即细胞质基因不能通过花粉或精子传递给下一代）

基因漂变常通过传粉过程进行，而受精过程中，雄配子只有细胞核基因传递给了下一代，细胞质基因并未传给下一代（即细胞质基因不能通过花粉或精子传递给下一代）

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