糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母CS115（对氨苄青霉素不敏感）中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。质粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因Amp^r转录的模板链属于b链的片段。三种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题。

限制酶	BamHⅠ	PstⅠ	XbaⅠ
识别序列和切割位点（5′→3′）	G↓GATCC	C↓TGCAG	T↓CTAGA

（1）为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到

淀粉

淀粉

含量高的培养基上，恒温培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈（不产生蓝色）直径

较大

较大

的菌株，再进行复筛以及稳定性遗传实验。
（2）质粒复制的模板链是

a和b

a和b

（选填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”）链。高产糖化酶基因插入质粒后，其转录的模板链属于

a

a

链的片段。
（3）构建高产糖化酶基因表达载体时，使用限制酶切割pPIC9K，37℃，15min后需将温度升高至65℃并保温20min,目的是使

限制酶失活

限制酶失活

，从而终止酶切反应。图2是高产糖化酶基因示意图（仅示部分碱基），为使其能定向插入表达载体并成功表达，则PCR扩增时引物的碱基序列为

①④

①④

。
①5′-TCTAGATCTGTTGAAT-3′②5′-TCTAGAAGACAACTTA-3′
③5′-CTGCAGCTTGGATGAT-3′④5′-GGATCCCTTGGATGAT-3′
⑤5′-GGATCCGAACCTACTA-3′⑥5′-CTCGAGTCTGTTGAAT-3′
（4）毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，因此可利用

不含组氨酸

不含组氨酸

的基础培养基（不含淀粉）初步筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕赤酵母GS115，再将筛选出的细胞转接至含甲醇的培养液中进行发酵产酶性能测定。