CRISPR/Cas9基因编辑方法的建立在生命科学领域掀起了一场技术革命，最近科学家又进一步设计了新的Cas9融合蛋白，可作为“单碱基编辑器“，作用原理如图1所示。这种融合蛋白包含dCas9蛋白和大鼠胞苷脱氨酶APOBECI两部分。dCas9蛋白可以结合一段sgRNA，这段sgRNA可以引导dCas9蛋白部分与特定的DNA序列结合。该融合蛋白的另一部分胞苷脱氨酶APOBEC1具有将识别部位特定位置的胞嘧啶转化为尿嘧啶（步骤①）的能力，之后通过DNA复制或修复，尿嘧啶被转化成胸腺嘧啶（步骤②）最终实现定点单个碱基的编辑替换。
（1）在上述“单碱基编辑器”中，sgRNA能特异识别某段特定DNA序列的原理是碱基互补配对碱基互补配对，被编辑的靶基因发生了基因突变基因突变。为了检测步骤①的编辑效率，科学家用USER酶（能识别DNA中尿嘧啶并将其切割成短片段）处理编辑后的DNA（染料标记），电泳后结果如图2，泳道AA代表DNA中的胞嘧啶转化为了尿嘧啶。
（2）科学家将以上方法用于斑马鱼体内基因组DNA的定点单碱基编辑。首先构建含特定sgRNA基因和APOBEC1基因和dCas9基因APOBEC1基因和dCas9基因基因的表达载体；利用显微注射显微注射法将体外表达的RNA导入斑马鱼的受精卵中。在细胞中经过翻译翻译形成dCas9和APOBEC1的融合蛋白质实现靶基因的编辑。
（3）已知tyr基因的点突变会导致人体眼白化疾病患者无法正常合成色素。图3为正常人体部分tyr基因序列和对应的氨基酸序列，其中第301位的脯氨酸（P）突变为亮氨酸（L）就会导致眼白化。
①为验证该位点脯氨酸（P）的作用。科学家找到斑马鱼tyr基因对应的位点和序列（见图3）。用上述方法单碱基编辑对应脯氨酸位点，将脯氨酸突变为丝氨酸，结果斑马鱼出现了如图4所示症状（箭头处），该实验说明脯氨酸是眼部合成色素所必需的脯氨酸是眼部合成色素所必需的。这为治疗疾病提供了有效的动物模型。
②若斑马鱼被编辑的碱基为图3箭头所示的C碱基，据图1和图3分析丝氨酸的密码子为UCCUCC。在正常个体中编码脯氨酸的密码子在人体和斑马鱼中却并不相同，这体现了密码子的简并性简并性。这种特点的存在具有什么意义降低基因突变的多害性降低基因突变的多害性。
【答案】碱基互补配对；基因突变；A；APOBEC1基因和dCas9基因；显微注射；翻译；脯氨酸是眼部合成色素所必需的；UCC；简并性；降低基因突变的多害性
【解答】
【点评】
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发布：2024/6/27 10:35:59组卷：66引用：4难度：0.7
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1．人类基因组计划测定了人体的24条染色体，这24条染色体是（ ）
发布：2024/12/31 0:30:1组卷：115引用：7难度：0.7 -
2．学习以下材料，回答（1）～（4）题。
利用抑制性tRNA进行无义突变遗传病的治疗
无义突变是由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子（UAA、UAG或UGA），从而使肽链合成提前终止，造成蛋白质的功能改变，引发相关疾病。约有10%～15%的人类基因相关遗传疾病是由无义突变引发的。常规的基因治疗是将正常基因的cDNA序列或是有治疗价值的基因（如CRISPR-Cas9相关的基因编辑工具）通过一定的方式导入人体靶细胞内，达到替代或修复缺陷基因、治疗疾病的目的。导入基因插入位置不当、过高或过低表达，都可能会导致副作用。尽管基因编辑可以实现生理水平的基因表达，但基因编辑工具引入外源蛋白可能引发强烈的免疫反应仍然是巨大的挑战。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而来，它的反密码子通过碱基配对原则可以识别无义突变的终止密码子，使得mRNA在翻译至无义突变位点时不启动翻译终止而是继续向后进行翻译，获得有功能的全长蛋白。
I型黏多糖贮积症的病因，是相关基因发生无义突变，产生终止密码子UAG。研究者构建小鼠该突变基因mldua和Flag基因融合的载体（图1），以及针对该无义突变设计的sup-tRNA表达载体（产生的sup-tRNA能够识别UAG并携带酪氨酸Tyr,简写作sup-tRNATyr），将其导入细胞进行研究，发现与具有相似作用的化合物G418比较，sup--tRNA的作用更加显著（图2）；进一步利用重组腺相关病毒作为载体将sup-tRNA导入患病小鼠模型中，实验显示能够降低黏多糖过度积存，实现对该病症的有效治疗，其疗效可以持续半年以上。
从整体来看，G418在促进跨越无义突变位点继续翻译时引入的氨基酸较为随机，而sup-tRNA引入的氨基酸较为单一，且不会影响内源tRNA稳态，所以sup-tRNA在个体治疗中具有很高的安全性，因而在未来基因突变引起的疾病相关治疗中具有非常大的应用前景。
（1）侵染时，作为载体的重组腺相关病毒与靶细胞膜上的发生识别，引发内吞，进入细胞后释放单链DNA作为模板，利用宿主细胞的催化合成其互补DNA链，再经过过程产生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸较为单一，不影响内源tRNA稳态，我们还可推断，用于治疗的sup-tRNA在正常终止密码子处（填“能”或“不能”）继续往后翻译，具有很高的安全性。
（3）研究者构建mldua突变基因和Flag基因融合的载体，目的是通过检测来确定是否跨越无义突变位点继续向后翻译。实验结果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促进无义突变位点的翻译方面更加有效，支持这一结论的依据是：。
（4）有文献报道，已在近1000个不同的人类基因中发现了7500多个无义突变。常规的基因治疗需要为每种疾病设计独特的治疗策略，这将是一项耗费惊人的项目。据此说明sup-tRNA的应用价值。发布：2025/1/3 8:0:1组卷：28引用：1难度：0.6 -
3．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，自然界有些植物能产生几丁质酶催化几丁质水解从而抵抗真菌感染。通过基因工程将几丁质酶基因转入没有抗性的植物体内，可增强其抗真菌的能力。如图表示为获取几丁质酶基因而建立cDNA文库的过程。
（1）图示以mRNA为材料通过法获得cDNA，该方法依据的原理是，通过这种方法获得的基因中因缺乏和结构，导致将其直接导入受体细胞中不能复制和表达。
（2）与选用老叶相比，选用嫩叶更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（3）将从cDNA文库中获得的几丁质酶基因和质粒载体用酶和DNA连接处理后连接起来，构建基因表达载体，DNA连接酶催化形成的化学键是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：5引用：1难度：0.7
