利用新冠病毒（SARS—CoV—2）包膜表面的S蛋白研发的疫苗已在我国广泛接种。如图表示制备疫苗的相关过程，其中m、n分别是启动子和终止子，箭头处是限制酶的切点，SUC2是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其终产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用。下表是可供选择使用的限制酶及其识别序列和切割位点。

限制酶	BamHI	NheI	NcoI	SphI	Sau3AI
识别序列和切割位点	5'-G↓CTAGC-3'	5'-G↓GATCC-3'	5'-C↓CATGG-3'	5'-GCATG↓C-3'	5'-↓GATC-3'

（1）已知依据S蛋白的RNA制备的目的基因S上无合适的限制酶识别序列，为了使目的基因S更好地与载体A连接，需要在PCR扩增之前设计两种引物分子，应在两种引物分子的

5'

5'

（填“5′”或“3′”）端添加合适的限制酶的识别序列。如图②过程所使用的两种酶是

NheI、NcoI

NheI、NcoI

，选择两种酶切割的优点是

形成不同的粘性末端，防止质粒及目的基因自连及目的基因反接

形成不同的粘性末端，防止质粒及目的基因自连及目的基因反接

。
（2）由图推测，目的基因S表达的模板链是

上链

上链

（填“上链”或“下链”），理由是

3'→5'方向与m→n相同

3'→5'方向与m→n相同

。
（3）RT一PCR是将RNA逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术。利用S蛋白的RNA作为模板进行过程①，首先需要加入缓冲液、原料、酶Ⅰ、引物Ⅰ等物质后进行RT，获得单链DNA后，还需要添加与单链DNA互补的引物Ⅱ及酶Ⅱ，在PCR过程中酶Ⅰ所处的状态是

失活

失活

。以一个单链DNA为起点，进行n次循环的扩增，理论上需要

2^n-1

2^n-1

个引物Ⅱ。
（4）SUC2作为B上的标记基因，可以对导入B的酵母菌进行筛选。筛选时，需要使用以蔗糖为唯一碳源的培养基，对受体突变型酵母菌的要求是

不含SUC2基因或者SUC2基因被敲除

不含SUC2基因或者SUC2基因被敲除

。