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黑胸大蠊是一种生活在我国南方地区的主要卫生害虫，通过生物防治手段可以起到一定抑制虫害的作用。某研究小组对黑胸大蠊浓核病毒的PfDNV基因与pUCl19质粒进行重组构建，通过感染黑胸大蠊研究其病理特征，已知KpnⅠ、PstⅠ、HindⅢ3种限制酶的酶切位点不同，Amp为氨苄青霉素抗性基因，实验过程图解如下。请分析回答下列问题：
（1）纯化后的PfDNV 基因可通过 PCRPCR技术扩增。常将PfDNV基因与pUC119质粒采取加G-C尾的连接方式构建重组质粒，该加尾的连接方式能使重组质粒的热稳定性 提高提高。
（2）研究小组将获得的重组质粒通过 感受态转化感受态转化处理法转染大肠杆菌，在含有 氨苄青霉素氨苄青霉素的培养基上培养一段时间后，挑选出部分菌株，用HindⅢ酶解菌株中的重组质粒，经电泳分析后发现有些菌株显示有5kb和3.7kb片段，还有些菌株显示有1.8kb和6.9kb片段，出现这种情况的原因是 基因和质粒的正向和反向连接基因和质粒的正向和反向连接。
（3）选择可以正常表达的重组质粒PfDNV-pUCl19，利用KpnⅠ酶酶解后回收7.3kb的片段，通过的DNA连接酶DNA连接酶作用获得Pf△Kpn-pUC119重组质粒，将两种重组质粒通过腹部注射法注入黑胸大蠊幼虫体内，所得的结果如表所示。
质粒转染黑胸大蠊实验结果
| 接种物 | 接种虫数 | 感染虫数 | 感染百分数（%） | |
| PfDNV-pUCl19 | 2500µg | 20 | 20 | 100 |
| 1250µg | 20 | 18 | 90 | |
| 250µg | 20 | 17 | 85 | |
| Pf△Kpn-pUC119 | 2300µg | 20 | 0 | 0 |
| 1000µg | 20 | 0 | 0 | |
| 野生型病毒 | 20 | 20 | 100 | |
| 未接种 | 20 | 0 | 0 | |
2500
2500
µg及以上时，虫体最终死亡率与野生型病毒感染的结果-致。Pf△Kpn-pUC119 重组质粒注射幼虫后没有感染的根本原因是：KpnⅠ酶酶解后再连接，导致 PfDNV基因缺失了部分片段
PfDNV基因缺失了部分片段
。【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】PCR；提高；感受态转化；氨苄青霉素；基因和质粒的正向和反向连接；DNA连接酶；2500；PfDNV基因缺失了部分片段
【解答】
【点评】
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发布：2024/5/23 20:38:36组卷：91引用：2难度：0.1
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（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
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