母源因子是初级卵母细胞在减数分裂Ⅰ前期的后段开始产生并积累的mRNA和蛋白质，其对于调控动物早期胚胎的发育十分重要。为研究不同母源因子的功能，相应母源突变体的培育显得尤为重要。
（1）母源因子由母源效应基因通过基因 转录、翻译转录、翻译过程产生，其产生并积累的时期由于同源染色体未分离，因此只有纯合突变的雌性个体的后代才是母源突变体。
（2）获得母源突变体的传统方法是反复交配与筛选。以母源效应基因A为例，科学家利用基因编辑技术将斑马鱼的一个A基因敲除后获得杂合子，记作（+/-）。如图1是获得母源突变体的杂交方案，请补全如图 
。
（3）传统交配筛选的方法存在耗时长、纯合的合子突变体的致死率高等缺陷。为了解决上述问题，科学家在CRISPR/Cas9基因编辑系统的基础上进行了改进。
①sgRNA编码序列能与相应靶基因序列发生碱基互补配对。为构建含有sgRNA编码序列的重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA用 限制酶限制酶处理，然后将其插入到经相同酶处理过的质粒上。斑马鱼的卵母细胞与精子受精前停滞在减数分裂Ⅰ前期，此时还未开始合成母源因子，在此阶段前对卵母细胞进行基因敲除可避免母源因子的积累。
②为了实现卵母细胞中基因的特异性敲除，如图2所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒后导入卵母细胞。从理论上分析，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析3个sgRNA串联有何优势，请答出2点 只构建一个表达载体即可，能准确插入到斑马鱼的基因组中，能通过绿色荧光进行筛选只构建一个表达载体即可，能准确插入到斑马鱼的基因组中，能通过绿色荧光进行筛选。
（4）I-SecI介导的基因插入率并不能达到100%，请根据上述研究分析如何在斑马鱼早期胚胎中筛选出突变体，并说明理由 重组质粒中含有荧光标记基因，若将重组质粒导入受体细胞，则可通过观察是否发出绿色荧光进行筛选重组质粒中含有荧光标记基因，若将重组质粒导入受体细胞，则可通过观察是否发出绿色荧光进行筛选。
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用．
【答案】转录、翻译；；限制酶；只构建一个表达载体即可，能准确插入到斑马鱼的基因组中，能通过绿色荧光进行筛选；重组质粒中含有荧光标记基因，若将重组质粒导入受体细胞，则可通过观察是否发出绿色荧光进行筛选
；限制酶；只构建一个表达载体即可，能准确插入到斑马鱼的基因组中，能通过绿色荧光进行筛选；重组质粒中含有荧光标记基因，若将重组质粒导入受体细胞，则可通过观察是否发出绿色荧光进行筛选【解答】
【点评】
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发布：2024/6/27 10:35:59组卷：41引用：1难度：0.5
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1．学习以下材料，回答（1）～（4）题。
利用抑制性tRNA进行无义突变遗传病的治疗
无义突变是由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子（UAA、UAG或UGA），从而使肽链合成提前终止，造成蛋白质的功能改变，引发相关疾病。约有10%～15%的人类基因相关遗传疾病是由无义突变引发的。常规的基因治疗是将正常基因的cDNA序列或是有治疗价值的基因（如CRISPR-Cas9相关的基因编辑工具）通过一定的方式导入人体靶细胞内，达到替代或修复缺陷基因、治疗疾病的目的。导入基因插入位置不当、过高或过低表达，都可能会导致副作用。尽管基因编辑可以实现生理水平的基因表达，但基因编辑工具引入外源蛋白可能引发强烈的免疫反应仍然是巨大的挑战。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而来，它的反密码子通过碱基配对原则可以识别无义突变的终止密码子，使得mRNA在翻译至无义突变位点时不启动翻译终止而是继续向后进行翻译，获得有功能的全长蛋白。
I型黏多糖贮积症的病因，是相关基因发生无义突变，产生终止密码子UAG。研究者构建小鼠该突变基因mldua和Flag基因融合的载体（图1），以及针对该无义突变设计的sup-tRNA表达载体（产生的sup-tRNA能够识别UAG并携带酪氨酸Tyr,简写作sup-tRNATyr），将其导入细胞进行研究，发现与具有相似作用的化合物G418比较，sup--tRNA的作用更加显著（图2）；进一步利用重组腺相关病毒作为载体将sup-tRNA导入患病小鼠模型中，实验显示能够降低黏多糖过度积存，实现对该病症的有效治疗，其疗效可以持续半年以上。
从整体来看，G418在促进跨越无义突变位点继续翻译时引入的氨基酸较为随机，而sup-tRNA引入的氨基酸较为单一，且不会影响内源tRNA稳态，所以sup-tRNA在个体治疗中具有很高的安全性，因而在未来基因突变引起的疾病相关治疗中具有非常大的应用前景。
（1）侵染时，作为载体的重组腺相关病毒与靶细胞膜上的发生识别，引发内吞，进入细胞后释放单链DNA作为模板，利用宿主细胞的催化合成其互补DNA链，再经过过程产生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸较为单一，不影响内源tRNA稳态，我们还可推断，用于治疗的sup-tRNA在正常终止密码子处（填“能”或“不能”）继续往后翻译，具有很高的安全性。
（3）研究者构建mldua突变基因和Flag基因融合的载体，目的是通过检测来确定是否跨越无义突变位点继续向后翻译。实验结果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促进无义突变位点的翻译方面更加有效，支持这一结论的依据是：。
（4）有文献报道，已在近1000个不同的人类基因中发现了7500多个无义突变。常规的基因治疗需要为每种疾病设计独特的治疗策略，这将是一项耗费惊人的项目。据此说明sup-tRNA的应用价值。发布：2025/1/3 8:0:1组卷：28引用：1难度：0.6 -
2．人类基因组计划测定了人体的24条染色体，这24条染色体是（ ）
发布：2024/12/31 0:30:1组卷：115引用：7难度：0.7 -
3．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，自然界有些植物能产生几丁质酶催化几丁质水解从而抵抗真菌感染。通过基因工程将几丁质酶基因转入没有抗性的植物体内，可增强其抗真菌的能力。如图表示为获取几丁质酶基因而建立cDNA文库的过程。
（1）图示以mRNA为材料通过法获得cDNA，该方法依据的原理是，通过这种方法获得的基因中因缺乏和结构，导致将其直接导入受体细胞中不能复制和表达。
（2）与选用老叶相比，选用嫩叶更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（3）将从cDNA文库中获得的几丁质酶基因和质粒载体用酶和DNA连接处理后连接起来，构建基因表达载体，DNA连接酶催化形成的化学键是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：5引用：1难度：0.7
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