厌氧微生物在自然界中分布广泛，种类繁多，作用也日益引起重视。由于它们不能代谢氧来进一步生长，且多数情况下氧气分子的存在对其有害，所以在进行分离、培养时必须处于去除氧的环境下。分离和培养厌氧菌的方法很多，碱性焦性没食子酸法是操作比较简单的方法之一。焦性没食子酸与碱溶液NaOH作用后形成易被氧化的碱性没食子盐，它能通过氧化作用除掉密封容器中的氧气。
菌种：巴氏芽孢梭菌（一种厌氧菌）、荧光假单胞菌。
培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
溶液或试剂：焦性没食子酸、10%NaOH溶液，灭菌的石蜡凡士林等。
仪器或其他用具：灭菌脱脂棉、灭菌的培养皿和培养皿盖等。
请完成下列实验步骤及相关问题：
（1）用灭菌完成的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基进行

倒平板

倒平板

（填操作步骤），待培养基凝固稍干燥后，在平板上最好采用

平板划线

平板划线

法一半接种巴氏芽孢梭菌，另一半接种荧光假单胞菌，并在皿底用记号笔作好标记。
（2）滴加10%NaOH溶液约2mL于焦性没食子酸上，切勿使溶液溢出脱脂棉，立即将

已接种的平板

已接种的平板

覆盖于培养皿盖上，必须将脱脂棉全部罩住，目的是既可以使碱性没食子盐充分去除氧气，又防止

培养皿和皿盖出现较大缝隙导致氧气和杂菌进入

培养皿和皿盖出现较大缝隙导致氧气和杂菌进入

，除此之外，焦性没食子酸反应物不能与培养基表面接触。最后，以溶化的石蜡凡士林液密封培养皿与皿盖的接触处，置30℃培养，定期观察平板上菌种的生长状况并记录。
（3）在进行厌氧培养时，同时接种荧光假单胞菌，它是一种

好氧

好氧

菌，目的是监测容器内的氧气环境。
（4）各种厌氧微生物对氧的耐受能力有所不同。以下是采用深层琼脂法（培养基不同深度含氧量不同）探究某种厌氧菌的耐氧能力实验：
用无菌生理盐水，制成菌悬液。将装有葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的试管置于100℃水浴中溶化并保温5～10min。将试管取出后，室温静置冷却至45～50℃时，无菌操作吸取0.1mL细菌悬液加入试管中，双手快速搓动试管（如图），目的是

使菌种均匀分布于培养基中

使菌种均匀分布于培养基中

，不采用震荡是避免达到目的的同时有过多的空气混入培养基。之后将试管置于冰浴中，使培养基迅速凝固。将上述试管置于28℃温室中静置保温48h后开始连续进行观察，直至结果清晰为止，根据

细菌在试管中的生长部位

细菌在试管中的生长部位

来判断细菌的耐氧能力大小。