为了研究低温诱导对某基因的启动子P活性的影响，科研人员进行了启动子P的PCR提取、特定表达载体的构建和转基因烟草的功能鉴定。该基因及其启动子P的结构及相应限制酶的切割位点如图1所示，如图1中灰色区域碱基序列是已知的，启动子P（图中黑色区域）及上游碱基序列未知，片段I和片段II中的字母A～F均表示引物。请回答下列问题。
（1）启动子是RNA聚合酶识别并结合RNA聚合酶识别并结合的位点。不能直接根据片段I扩增启动子P的原因是启动子P及左侧的序列未知，无法合成PCR所需要的引物启动子P及左侧的序列未知，无法合成PCR所需要的引物。
（2）为了能扩增正常启动子P，科研人员先用酶1和DNA连接酶1和DNA连接酶处理上图中的片段I，使片段I成为环状DNA；再将环状DNA用酶2酶2（填“酶1”或“酶2”）处理得到了片段II，如图2所示。根据片段II能不能扩增出启动子P？若能，请写出可选用的引物组合（用C、D、E、F表示），若不能请说明理由能，可选用的引物组合是D和E能，可选用的引物组合是D和E。
（3）已知卡那霉素可抑制烟草细胞的生长，基因M可在烟草的根部正常表达，其表达产物可将X-Gluc水解生成蓝色物质。将启动子P和基因M结合并与含有卡那霉素抗性基因的Ti-质粒重组构建基因表达载体。将表达载体和酚类物质混合后加入含有烟草细胞的培养基中，酚类物质的作用是吸引农杆菌感染烟草细胞吸引农杆菌感染烟草细胞。再用含有卡那霉素卡那霉素的培养基筛选出所需的烟草细胞，然后经过组织培养组织培养获得转基因烟草植株。
（4）将上述转基因烟草植株分为A、B两组，A组在常温（25℃，对照组）下培养，B组在低温（4℃，实验组）下培养，一段时间后取A、B的幼根，浸入适量X-GlucX-Gluc溶液中，观察烟草细胞中基因M的表达情况（表达强度越大，细胞表现的蓝色越深）。若A、B组的结果分别为A蓝色较深、B蓝色较浅A蓝色较深、B蓝色较浅，则说明低温抑制启动子P的功能。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】RNA聚合酶识别并结合；启动子P及左侧的序列未知，无法合成PCR所需要的引物；酶1和DNA连接；酶2；能，可选用的引物组合是D和E；吸引农杆菌感染烟草细胞；卡那霉素；组织培养；X-Gluc；A蓝色较深、B蓝色较浅
【解答】
【点评】
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发布：2024/4/20 14:35:0组卷：34引用：4难度：0.7
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（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
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