铜绿假单胞菌常常引起禽类、水貂等发生败血症及呼吸系统感染等疾病，给养殖业带来严重损失。科研人员尝试克隆和表达该菌外膜蛋白oprD基因，以用于后期的疫苗研制工作。相关限制酶识别序列及用于构建基因表达载体的质粒图示如图，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，请回答下列问题：

限制酶	识别序列
BamHⅠ	5'-G↓GATCC-3'
EcoRⅠ	5'-G↓AATTC-3'
NotⅠ	5'-GC↓GGCCGC-3
XhoⅠ	5'-C↓TCGAG-3'

（1）目的基因只有正确插入

启动子和终止子

启动子和终止子

之间才能正确表达。在表达载体中AmpR作为

标记基因

标记基因

。
（2）若已知铜绿假单胞菌的oprD基因序列，可利用PCR技术快速大量扩增该基因，PCR 扩增的原理是

DNA半保留复制

DNA半保留复制

，为使 PCR反应体系中的模板解为单链，需要满足的条件是

加热（90℃以上）

加热（90℃以上）

。为便于扩增的oprD基因与表达载体的连接，在设计引物时，常在两条引物的

5'

5'

端加上限制酶的识别序列，设计后的引物如下：
引物1：5′-CGGGATCCATGAAAGTGATGAAGTGG-3′
引物2：5′-CCCTCGAGTTACAGGATCGACAGCGG-3′
（3）根据上题中的引物信息分析，在构建oprD基因表达载体时，可选择

BamHⅠ

BamHⅠ

和

XhoⅠ

XhoⅠ

两种不同的限制酶同时切割目的基因和质粒，以提高目的基因和质粒的重组效率。
（4）将基因表达载体与经

Ca²⁺

Ca²⁺

处理 的处于感受态的受体菌细胞于缓冲液中混合，完成转化过程。将完成转化的受体菌接种在加有

氨苄青霉素

氨苄青霉素

的培养基上初步筛选后，再进-步检测、鉴定。