心脏移植是挽救终末期心脏病患者生命唯一有效的手段，然而心脏移植过程中会发生缺血再灌注损伤（IRI），可能导致心脏坏死。研究发现，IRI通过促进Caspase8等一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官损伤。根据Caspase8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以使Caspase8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官损伤。图1是利用猪的心肌细胞开展siRNA作用研究的示意图，图2是此研究可能用到的4种限制酶及其切除位点。回答下列问题：
（1）图1中步骤②构建重组质粒需要使用多种工具酶。常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。图2中 EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、PstⅠ酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA连接酶连接，图中 EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRVEcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRV酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 磷酸二酯键磷酸二酯键。
（2）图1中步骤③将重组质粒导入猪的心肌细胞最常用的方法是 显微注射法显微注射法。siRNA对应DNA序列在心肌细胞中表达产生siRNA的步骤④称为 转录转录。siRNA与RISC组装形成基因沉默复合物，通过抑制基因表达的 翻译翻译过程，使Caspase8基因沉默，从而降低IRI引起的细胞凋亡。
（3）研究人员根据Caspase8基因的碱基序列，设计了三种序列分别导入猪的心肌细胞，通过测定靶基因Caspase8的mRNA含量来确定最优序列。测定mRNA含量时，需提取心肌细胞的总RNA，经过逆转录逆转录过程得到cDNA，再进行PCR扩增，测定PCR产物量，结果如图3所示。据此判断最优序列是 序列2序列2。
（4）选用猪的心肌细胞作受体细胞是因为猪在基因、解剖结构、生理生化和免疫反应等方面与人类极为相似。为了解决心脏移植供体短缺问题，许多科学家正在研究用猪心脏代替人的心脏。你认为将猪心脏移植到人体面临的最大挑战是 免疫排斥反应免疫排斥反应。
【答案】EcoRⅠ、PstⅠ；EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRV；磷酸二酯键；显微注射法；转录；翻译；逆转录；序列2；免疫排斥反应
【解答】
【点评】
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发布：2024/7/25 8:0:9组卷：41引用：4难度：0.6
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（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
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