小麦纯合自交系川农16具有穗大、粒多、抗病等优良特性，可通过导入抗除草剂基因bar使其获得抗除草剂性状，具体技术路线如图1所示。其中抗除草剂基因bar来源于野生型植物甲，抗草甘膦基因aroA是选择标记基因，报告基因能在特定情况特定组织中表达。
（1）图1中构建表达载体的过程需要用两种不同的限制酶切割，比用一种限制酶切割的优点是

防止目的基因末端任意链接、防止目的基因自身环化、防止目的基因反向连接

防止目的基因末端任意链接、防止目的基因自身环化、防止目的基因反向连接

。很多启动子具有物种特异性，在图中Ti质粒的T-DNA中插入除草剂抗性基因bar时其上游启动子应该选择

C

C

。
A．野生植物甲启动子
B．农杆菌启动子
C．小麦川农16的启动子
（2）农杆菌转化愈伤组织时，T-DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选已转化的愈伤组织，需使用含

除草剂

除草剂

的选择培养基。但在转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。用K分别处理以下愈伤组织，出现蓝色的是

②④

②④

（多选）。
①无农杆菌附着的未转化愈伤组织
②无农杆菌附着的转化愈伤组织
③农杆菌附着的未转化愈伤组织
④农杆菌附着的转化愈伤组织
（3）转化后经筛选的愈伤组织需转换培养基继续培养，此时培养基需添加的植物激素为

生长素、细胞分裂素

生长素、细胞分裂素

，部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是

植物细胞具有全能性，芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化

植物细胞具有全能性，芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化

。培养获得的转基因植株不一定稳定遗传，须将转基因植株进行

自交

自交

，继续筛选，最终选育出抗除草剂纯合系。
（4）T-DNA序列可随机插入到愈伤组织DNA中导致插入位点基因功能丧失。上述实验中偶然获得了一个突变体F，产量明显低于小麦川农16。研究者用某种限制酶处理突变体F的DNA，得到图2，若以此为模板进行PCR扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，需选择的引物是

①④

①④

。