酯酶结合荧光分析法可对有机磷和氨基甲酸酯类农药进行检测，某研究院利用转基因技术获得一种催化效率高、农药敏感性强的微生物酯酶。

（1）人工合成酯酶基因后通过PCR技术可实现扩增，为该过程提供能量的是

dNTP

dNTP

；还需要设计两种引物，设计引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的

3′端

3′端

开始连接脱氧核苷酸。为方便构建重组质粒，需要在引物的5′端设计

限制（性内切核酸）

限制（性内切核酸）

酶的识别序列。某质粒图谱和目的基因的序列如图所示，应选择引物

①③

①③

（填数字）。（①-④中加粗表示识别序列前的保护碱基，增强上述酶与目的基因的结合。）
①5′-CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3′
②5′-CCCAAGCTTTACGAACTATACGGTTAG-3′
③5′-CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3′
④5′-CCGGAATTCGATCAGCTTGTGTTCTTC-3′
（2）若提取高产酯酶野生菌的基因组DNA，用设计的引物和合适的条件进行PCR，其产物可用

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳

鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能原因是：

在基因组DNA中有其他引物结合的位点/引物特异性不强/引物过短

在基因组DNA中有其他引物结合的位点/引物特异性不强/引物过短

。
解决措施：在目的基因的

上、下游

上、下游

（填“内部”或“上、下游”）重新设计引物进行PCR。
（3）将PCR产物和质粒用限制酶酶切，酶切产物纯化后，用DNA连接酶连接，这一操作的目的是

让目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用

让目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用

。