基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。科学家常借助基因敲除技术，使特定的基因功能丧失，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。来源于λ噬菌体的Red同源重组系统就可用于大肠杆菌等一系列工程菌的基因敲除。
（1）Red同源重组由λ噬菌体的exo、bet、gam3个基因组成，分别编码EXO、BET、GAM3种蛋白质，EXO为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA的末端，产生3′黏性末端；BET结合在EXO外切产生的末端单链上，促进其与受体细胞内正在复制的靶序列进行同源重组，替换靶基因；GAM蛋白能够抑制受体细胞内核酸外切酶活性，进而

抑制

抑制

（选填“抑制”或“促进”）受体细胞对外源DNA的降解。
（2）Red同源重组技术要用到质粒pKD46，该质粒含有温度敏感型的复制起点oriR101，在30℃培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失；还有由ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，需要L-阿拉伯糖诱导表达。λ-Red系统介导的基因敲除过程如图所示。
①将pKD46导入处于

感受态

感受态

（某种状态）的大肠杆菌，为使pKD46在细菌内正常复制、Red重组酶正常合成，必需满足

培养温度为30℃，且培养基中含L-阿拉伯糖

培养温度为30℃，且培养基中含L-阿拉伯糖

的培养条件。过程I是用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，这说明

实验用大肠杆菌不含青霉素抗性基因（或在含青霉素培养基中不能存活）且pKD46质粒含有青霉素抗性基因

实验用大肠杆菌不含青霉素抗性基因（或在含青霉素培养基中不能存活）且pKD46质粒含有青霉素抗性基因

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②用PCR技术扩增卡那霉素抗性基因，将获得的线性DNA片段导入大肠杆菌，通过同源重组将大肠杆菌基因组DNA上的特定靶基因敲除。
③为筛选出同源重组成功（即靶基因被敲除）的大肠杆菌，过程II所用的培养基必需含有

卡那霉素

卡那霉素

；然后在

高于37℃的温度下培养

高于37℃的温度下培养

，把质粒pKD46除去。
④Red同源重组技术要用到质粒pKD46，该质粒含有ParaB启动子，负责调控exo、bet、gam基因，ParaB启动子的作用是

是RNA聚合酶识别及结合的部位，驱动exo、bet、gam基因转录出mRNA

是RNA聚合酶识别及结合的部位，驱动exo、bet、gam基因转录出mRNA

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