可用作生物表面活性剂的鼠李糖脂不仅具有优异的功能稳定性，还具有无毒、无污染、可被生物降解等优点，因而在医药、食品、农业、石油开采、环境污染修复等领域展示了其独特的应用前景。可合成鼠李糖脂的天然菌株存在致病性等缺点，而异源菌株中往往存在合成鼠李糖脂的重要前体物质，理论上只要将外源基因插入该菌株进行异源表达即可合成鼠李糖脂。某科研团队选择在无致病的异源菌株恶臭假单胞菌（P.jye.ai）中插入外源基因rhIA以合成鼠李糖脂。已知表达载体pBBRmcs-5的MCS含有多种限制性核酸内切酶的单一切点，GmR为庆大霉素的抗性基因。请回答：
（1）利用PCR技术获取外源基因rhIA：以下可提供外源基因rhIA模板的菌株有 ③④③④。
①P.jye.ai②E.coli③P.aeruginosa④Burkholderia sp
（2）因外源基因rhIA不含有MCS中的限制酶酶切位点，需对上述PCR产物进行二次PCR扩增。二次PCR所使用的引物应该在第一次PCR引物的 5′5′（填“3′”或“5′”）端插入包含限制酶酶切位点的序列。在上游引物所插入的序列含有5′AGGGCGAATTGGAGCTC3′，下游引物插入的序列含有5′GCTTGATATCGAATTCGA3′。
（3）基因表达载体构建：将表达载体pBBRmcs-5与上述扩增产物用SacⅠ和 EcoRⅠEcoRⅠ限制性核酸内切酶酶切后进行连接。
（4）将目的基因导入受体细胞：用 Ca2+（或CaCl₂）Ca2+（或CaCl₂）处理P.jye.ai使其处于能够吸收外源DNA的生理状态，与上述基因农达载体混合培养一段时间。
（5）目的基因的检测与鉴定：
①用稀释涂布法将培养液接种到含庆大霉素的 选择选择（填“选择”或“鉴别”）培养基上培养以检测表达载体是否导入重组菌株。
②通过PCR技术可检测 abab。
a.表达载体pBBRmcs-5是否含有外源基因rhIA
b.外源基因rhIA是否转录出mRNA
c.外源基因rhIA是否表达出相应的蛋白质
③测定发酵液中 鼠李糖脂鼠李糖脂的含量。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】③④；5′；EcoRⅠ；Ca2+（或CaCl₂）；选择；ab；鼠李糖脂
【解答】
【点评】
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发布：2024/4/20 14:35:0组卷：19引用：1难度：0.6
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（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
