癌细胞表面蛋白“PD-L1”与T细胞表面蛋白“PD-1”特异性结合后，可抑制T细胞活性并启动其凋亡，导致癌细胞发生免疫“逃逸”。研究者对“PD-1”基因进行克隆、表达及生物学活性鉴定，为制备抗体打基础。研究中所用引物α和β碱基序列见图1，几种常用限制酶名称及识别序列与酶切位点见图2。请据图回答下列问题：
（1）首先提取细胞中的mRNA反转录生成

cDNA

cDNA

作为模板：设计含有不同的酶切位点的α和β序列为引物，通过

PCR

PCR

技术扩增目的基因。
（2）选用图2中的两种名称分别为

XhoI、EcoRI

XhoI、EcoRI

的限制酶将“pIRES2-EGFP质粒”载体进行双酶切，再用DNA连接酶将其与目的基因拼接，构建表达载体。该表达载体的组成，除了目的基因、标记基因（抗卡那霉素基因）外，还必须具

启动子、终止子、复制原点

启动子、终止子、复制原点

等。

（3）而后在一定温度下，将重组质粒与经过Ca²⁺中处理的感受态大肠杆菌混合培养在含有

卡那霉素

卡那霉素

的培养基中，可筛选出已经完成转化的大肠杆菌，继续培养该种大肠杆菌以扩增重组DNA。
（4）将扩增后的“pIRES2-EGFP载体/PD-1重组DNA”转入可高度表达外源基因的原代293T细胞。一段时间后，为确定“PD-1”基因是否表达，检测细胞膜表面是否具有

PD-1蛋白

PD-1蛋白

。为判断其是否具有生物学活性和功能，则可裂解293T细胞，提取该物质看能否与

PDL-1

PDL-1

发生结合从而阻断“PD-1与PD-L1信号通路”。研究中还会有一步骤，只将“pIRES2-EGFP载体”转入293T细胞，其目的是

作为对照

作为对照

。如果大肠杆菌是受体细胞，为使重组质粒较易导入大肠杆菌，需先用

钙离子

钙离子

处理大肠杆菌。