酯酶结合荧光分析法可对有机磷和氨基甲酸酯类农药进行检测，某研究院利用转基因技术获得一种催化效率高、农药敏感性强的微生物酯酶。

（1）人工合成酯酶基因后通过PCR技术可实现扩增，需要设计两种引物，设计引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的

3’端

3’端

开始连接脱氧核苷酸。为方便构建重组质粒，需要在引物的

5’

5’

端设计

限制性内切核酸

限制性内切核酸

酶的识别序列。某质粒图谱和目的基因的序列如上图所示，应选择引物

①③

①③

（填数字）。（①-④中加粗表示识别序列前的保护碱基，增强上述酶与目的基因的结合）
①5’-CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3’
②5’-CCCAAGCTTATGCTTGATATGCCAATC-3’
③5’-CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3’
④5’-CCGGAATTCCTAGTCGAACACAAGAAG-3’
（2）若提取高产酯酶野生菌的基因组DNA，用设计的引物和合适的条件进行PCR，其产物可用

（琼脂糖凝胶）电泳

（琼脂糖凝胶）电泳

鉴定。结果发现有目的基因以外的杂交带存在，分析可能原因是：

在基因组DNA中有其他引物结合的位点/引物特异性不强/引物过短

在基因组DNA中有其他引物结合的位点/引物特异性不强/引物过短

。解决措施：在目的基因的

上、下游

上、下游

（填“内部”或“上、下游”）重新设计引物进行PCR。

限制酶	识别序列与切割位点	限制酶	识别序列与切割位点
PstⅠ	5’-CTGCA↓G-3’	NdeⅡ	5’-↓GATC-3’
HindⅢ	5’-A↓AGCTT-3’	EcoRⅠ	5’-G↓AATTC-3’
DpnⅡ	5’-↓GATC-3’	AluⅠ	5’-AG↓CT-3’

（3）将PCR产物和质粒用限制酶酶切，酶切产物纯化后，用

DNA连接酶

DNA连接酶

连接，连接产物导入大肠杆菌前需用

Ca²⁺（氯化钙溶液）

Ca²⁺（氯化钙溶液）

处理大肠杆菌，使其处于感受态。