非霍奇金淋巴瘤是一种原发于淋巴组织的血液系统恶性肿瘤，其细胞表面高表达CD19蛋白。CAR-T（嵌合抗原受体T细胞）疗法是利用基因工程的方法使T细胞表面表达能够靶向特定抗原的受体（CAR），改造后的T细胞被称为CAR-T，可以识别并攻击带有特定抗原的肿瘤细胞，同时激活机体自身免疫从而达到抗肿瘤的效果。请回答下列问题：

（1）目前制备CAR-T细胞大多是采用慢病毒感染的方式使T细胞表达CAR。
①获取CAR基因（实质为抗CD19蛋白的抗体基因）：将抗CD19蛋白的抗体基因作为PCR反应的模板，并依据

抗CD19蛋白抗体基因两端的部分核苷酸序列

抗CD19蛋白抗体基因两端的部分核苷酸序列

设计一对特异性引物来扩增该基因。
②构建基因表达载体：图1为所用载体示意图，图2为限制酶的识别序列及切割位点。为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的

5’

5’

端分别引入

Pvit2、EcoRI

Pvit2、EcoRI

两种不同限制酶的识别序列。在目的基因和载体连接时，可选用

T4DNA连接酶

T4DNA连接酶

（选填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
③将目的基因导入受体细胞：将重组质粒通过

显微注射

显微注射

技术导入到T细胞。
④重组质粒的筛选与鉴定：将转化后的T细胞置于含

嘌呤霉素

嘌呤霉素

的培养基上进行培养，进一步通过流式细胞术验证CAR-T细胞的构建是否成功。
（2）采用病毒作为递送载体存在随机插入的安全隐患，CRISPR/Cas9技术作为第三代基因编辑工具（图3），sgRNA可引导Cas9蛋白在特定位点进行切割来完成基因的编辑。科学家利用该技术制备的CAR-T细胞，在非霍奇金淋巴瘤临床前的治疗中取得理想效果。其操作原理如图4所示。
①sgRNA能与靶基因特异性识别、结合的原理是

（sgRNA与靶基因）碱基互补配对

（sgRNA与靶基因）碱基互补配对

，基因编辑工具中对基因进行剪切的是

Cas9蛋白

Cas9蛋白

。
②肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白和T细胞表面的PD-1受体结合，发出免疫抑制信号，实现免疫逃逸。该研究团队利用CRISPR/Cas9技术切割T细胞中PD-1基因的同时导入靶向PD-1基因的同源重组序列，利用同源重组修复的原理将

抗CD19蛋白的抗体基因

抗CD19蛋白的抗体基因

重组在PD-1基因内部，制备了非病毒定点整合的CAR-T细胞，如图4。
③综合上述信息分析，与慢病毒制备的CAR-T细胞相比，该方案制备的CAR-T细胞在非霍奇金淋巴瘤的治疗中的优点有：可以

定向

定向

插入抗CD19蛋白的抗体基因，降低随机插入的安全隐患，提高CAR-T细胞的安全性；可以使PD-1基因突变，降低肿瘤细胞

免疫逃逸

免疫逃逸

的可能性，提高CAR-T细胞的有效性。