基因工程自20世纪70年代兴起后，在短短的30年间，得到了飞速的发展，目前已成为生物科学的核心技术。基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：
（1）目的基因的获取：
①如果目的基因的核苷酸序列是已知的，可用

化学合成法

化学合成法

合成目的基因，或者用PCR技术扩增目的基因；
②如果目的基因的核苷酸序列是未知的，可以建立一个包括该种生物所有基因的基因组文库，或者通过

逆转录

逆转录

方法建立cDNA文库。
（2）基因表达载体的构建：
①对于遗传背景未知的生物，可提取该生物的基因组DNA，用多种

限制

限制

酶切割成各种不同DNA片段，分别导入大肠杆菌（如图所示）。由于切割后的基因片段大小不一，有的片段可能含有多个基因，不宜直接导入表达载体，所以可以先将它们分别与克隆质粒（如PBR322）连接构建重组载体，利用加入

氨苄青霉素

氨苄青霉素

的培养基筛选得到多个大肠杆菌菌落，不同的菌落中含有

相同或不同

相同或不同

（“相同”、“不同”、“相同或不同”）的基因。将转移到纤维素膜上的细菌裂解，释放出DNA，利用分子杂交技术检测目的基因，依据图示杂交带，可进一步选取

b

b

菌落（填写图中字母）继续培养，从而获得含有目的基因的受体菌。再将获得的目的基因与相应的质粒（如pET）连接构建表达载体，pET质粒含有卡那霉素抗性基因、复制原点外，还必须有

启动子和终止子

启动子和终止子

，以利于DNA片段在受体细胞中进行表达。
②与上述方法相比，通过cDNA文库获取的目的基因，可直接与pET质粒连接构建表达载体，理由是

cDNA片段较小

cDNA片段较小

。

（3）将目的基因导入受体细胞：
如果目的基因来自真核细胞的基因组DNA序列，转化的受体细胞一般不能为大肠杆菌，若目的基因来自cDNA文库，则受体细胞可不受限制，原因是

cDNA序列无内含子，真核细胞基因序列中含有内含子，大肠杆菌等原核细胞无法对内含子转录片段进行剪切修饰

cDNA序列无内含子，真核细胞基因序列中含有内含子，大肠杆菌等原核细胞无法对内含子转录片段进行剪切修饰

。
（4）目的基因的检测与鉴定：
导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，需要通过分子水平检测和个体生物学水平鉴定。