PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 逆转录逆转录过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 ECORⅠECORⅠ和 PstⅡPstⅡ两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 T4DNA连接酶T4DNA连接酶（填“E.coli DNA连接酶”或“T4DNA连接醇”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
| 名称 | 识别序列及切割位点 | 名称 | 识别序列及切割位点 |
| HindⅢ | A↓AGCTT TTCGA↑A |
ECORⅠ | G↓AATTC CTTAA↑G |
| PstⅡ | CAG↓CTG GTC↑GAC |
PstⅠ | CTGC↓AG GA↑CGTC |
| KpnⅠ | G↓GTACC CCATG↑G |
BamHⅠ | G↓GATCC CCTAG↑G |
（3）转化前需用caCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于
感受态
感受态
的生理状态，以提高转化效率。（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取单菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，
3
3
号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。（5）将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的
G2/M
G2/M
（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。【考点】细胞增殖的意义和细胞周期．
【答案】逆转录；ECORⅠ；PstⅡ；T4DNA连接酶；感受态；3；G2/M
【解答】
【点评】
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发布：2024/6/27 10:35:59组卷：343引用：3难度：0.6
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1．细胞从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期，以下为细胞周期的几种检测方法，分析回答相关问题。
（1）BrdU渗入测定细胞周期的方法：BrdU加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料。若 DNA-条单链渗入了BrdU时，染色体表现为深色，若DNA两条单链均渗入了BrdU时，染 色体表现为浅色。细胞如果处于第一个周期的中期，则细胞中每条染色体均有条单体为深色。细胞如果处于第三个周期的中期，则由同一细胞分裂所得所有细胞中全部染色体中，两条单体均为浅色的染色体占的比例为。统计分裂中各期比例，就可算出细胞周期的值。
（2）同位素标记法测定细胞周期：为测定某种细胞分裂的细胞周期，利用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸短暂培养该种细胞一段时间后，处于S期的细胞都会被标记。洗脱含放射性同位素的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，再换用无放射性的新鲜培养液培养，定期检测。不同间隔时间取样，结果如图1所示。
A：处于S期的细胞都被3H标记；B：被标记细胞最早进入分裂期；C：50%分裂期细胞被标证且在增加；D：50%分裂期细胞被标记且在减少；E：出现被标记细胞第二次进入分裂期。则这种细胞的S期为h。
（3）流式细胞仪PI染色法：由于细胞周期各时相的DNA含量不同，PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量送行检测，可以将细胞周期各时期区分开来，获得流式DNA含量图进而计算出细胞周期的值。
图2为某二倍体生物（2N）细胞周期测定所得流式DNA含量图，图中b点对应的细胞染色体数目为（填“2N”、“4N”或“2N或4N”），与对照组相比，实验组可能是经过了处理（填“DNA合成抑制剂”或“秋水仙素”）。发布：2025/1/3 8:0:1组卷：52引用：1难度：0.5 -
2．细胞周期包括分裂间期（分为G1期、S期和G2期）和分裂期（M期）。如图1标注了甲动物肠上皮细胞的细胞周期各阶段的时长及DNA含量。图2为用某抗癌药物处理体外培养的该动物的癌细胞，24小时后用液式细胞仪（可根据细胞中DNA含量的不同对细胞分别计数）的检测结果。请回答下列问题：
（1）乙动物肠上皮细胞的细胞周期时长为24 h,M期时长为1.9 h。若要在显微镜下观察细胞有丝分裂过程中染色体形态的变化，选用（填“甲”或“乙”）动物肠上皮细胞更合适。原因是。
（2）乙图中a峰和b峰之间的细胞正处于（填“G1”、“S”、“G2”、“M”）期。由图乙可推测抗癌药物抑制癌细胞增殖的机理可能是抑制了过程。
（3）细胞癌变的根本原因是。
（4）若用含放射性同位素的胸苷（DNA复制的原料之一）短期培养甲动物肠上皮细胞后，处于S期的细胞都会被标记。洗脱含放射性同位素的胸苷，换用无放射性的新鲜培养液培养，定期检测。预计最快约h后会检测到被标记的M期细胞。
（5）若向甲动物肠上皮细胞培养液中加入过量胸苷，处于S期的细胞立刻被抑制，而处于其他时期的细胞不受影响。预计加入过量胸苷约h后，细胞都将停留在S期。发布：2025/1/15 8:0:2组卷：18引用：1难度：0.6 -
3．细胞周期同步化是指利用一定方法使细胞群体处于同一细胞周期同一阶段的过程。如图是动物细胞周期同步化的方法之一，G1、S、G2、M期依次分别为10h、7h、3.5h、1.5h。使用DNA合成抑制剂选择性阻断S期，去除抑制剂后S期可继续进行，从而实现细胞周期同步化。下列叙述错误的是（ ）
发布：2024/12/31 0:0:1组卷：11引用：3难度：0.7
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