研究者将酿酒酵母S288c的APAl基因与EGFP（增强型绿色荧光蛋白）基因构成融合基因，并进一步构建表达载体（如图甲所示）。以该载体为模板，再通过PCR介导的定点突变技术向APAl基因中分别引入突变位点，经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR技术的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图乙所示，其中引物箭头代表子链延伸方向。回答下列问题：
（1）构建表达载体时，应将融合基因放于 启动子启动子、终止子终止子等结构之间，以保证目的基因的转录。为实现质粒和融合基因的高效连接，切割质粒时选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是 SmaI的酶切末端为平末端，无法与融合基因上的黏性末端连接SmaI的酶切末端为平末端，无法与融合基因上的黏性末端连接。为将融合基因构建在质粒上，还需要 BglII、DNA连接酶BglII、DNA连接酶等酶。
（2）利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2）。在PCR1中，至少需要 22个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中？处的引物应选用大引物两条链中的 ②②（填“①”或“②”）链的子链。
（3）若在荧光显微镜下观察到受体细胞有绿色荧光，则表明 APAl基因与EGFP基因已经表达（或融合基因形成了蛋白质产物）APAl基因与EGFP基因已经表达（或融合基因形成了蛋白质产物），EGFP基因的作用是 作为标记基因，用于目的基因的检测和鉴定作为标记基因，用于目的基因的检测和鉴定。
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【答案】启动子；终止子；SmaI的酶切末端为平末端，无法与融合基因上的黏性末端连接；BglII、DNA连接酶；2；②；APAl基因与EGFP基因已经表达（或融合基因形成了蛋白质产物）；作为标记基因，用于目的基因的检测和鉴定
【解答】
【点评】
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发布：2024/6/27 10:35:59组卷：26引用：3难度：0.6
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发布：2025/1/5 8:0:1组卷：6引用：1难度：0.7 -
2．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6 -
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