为研究igf2bp3基因的功能，研究者以斑马鱼为研究对象，通过CRISPR/Cas9技术构建igf2bp3基因缺失的突变模型。请回答下列问题：
（1）如图1示意CRISPR/Cas9的基本原理。向导RNA （gRNA） 5'5'端序列识别基因组DNA上的靶点，引导Cas9蛋白在特定位点上切断DNA双链。双链断裂的DNA可能通过非同源性末端连接修复导致DNA片段的缺失、倒位等而导致突变，称为“中靶”：也可能因同源重组修复将双链断裂的DNA恢复到原始序列，导致 脱靶脱靶效应。
（2）gRNA的合成与纯化。设计并合成特定的引物（图2示意引物之一：T7-靶点序列6-sfd），以pMD19-gRNA scaffold 质粒为模板，按照PCR反应程序：预变性5min；变性30s,退火30s,延伸40s,35个循环；再延伸10min。再延伸时间较长的目的是 把没有延伸完的片段补全（子链得到充分的延伸）把没有延伸完的片段补全（子链得到充分的延伸）。扩增出的DNA在体外转录出gRNA并纯化。如图2中T7启动子的作用是 利于T7RNA聚合酶识别并启动转录利于T7RNA聚合酶识别并启动转录。
（3）突变体的构建与筛选。受精卵分成2组，通过 显微注射显微注射技术注入特定浓度的Cas9蛋白和gRNA混合液1μL作实验组，另一组不注入作对照。欲判断靶点敲除是否有效，可 随机随机挑选实验组20枚发育48h的胚胎提取DNA用于鉴定。若有效，剩下的胚胎培养至性成熟即Fo。
（4）igf2bp3基因在不同组织中的表达。为了解igf2bp3基因在野生型斑马鱼不同组织中的表达量，研究人员提取了年龄为90天的野生型斑马鱼生殖腺等不同组织的 总RNA总RNA，逆转录后进行定量PCR，结果见图3。
（5）结果与分析。检测、筛选出F0嵌合体斑马鱼与野生型交配得F1，选择其中的杂合突变体自由交配，理论上F2中突变纯合子比例为 1414。统计 F2成年斑马鱼性别比例，杂合突变体中雌性占一半，而突变纯合子中雌性比例极低。请尝试作出合理的解释。 igf2bp3基因被敲除后，卵巢的发育受到抑制igf2bp3基因被敲除后，卵巢的发育受到抑制。
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【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用．
【答案】5'；脱靶；把没有延伸完的片段补全（子链得到充分的延伸）；利于T7RNA聚合酶识别并启动转录；显微注射；随机；总RNA；；igf2bp3基因被敲除后，卵巢的发育受到抑制
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【解答】
【点评】
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发布：2024/4/20 14:35:0组卷：31引用：1难度：0.7
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1．人类基因组计划测定了人体的24条染色体，这24条染色体是（ ）
发布：2024/12/31 0:30:1组卷：115引用：7难度：0.7 -
2．学习以下材料，回答（1）～（4）题。
利用抑制性tRNA进行无义突变遗传病的治疗
无义突变是由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子（UAA、UAG或UGA），从而使肽链合成提前终止，造成蛋白质的功能改变，引发相关疾病。约有10%～15%的人类基因相关遗传疾病是由无义突变引发的。常规的基因治疗是将正常基因的cDNA序列或是有治疗价值的基因（如CRISPR-Cas9相关的基因编辑工具）通过一定的方式导入人体靶细胞内，达到替代或修复缺陷基因、治疗疾病的目的。导入基因插入位置不当、过高或过低表达，都可能会导致副作用。尽管基因编辑可以实现生理水平的基因表达，但基因编辑工具引入外源蛋白可能引发强烈的免疫反应仍然是巨大的挑战。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而来，它的反密码子通过碱基配对原则可以识别无义突变的终止密码子，使得mRNA在翻译至无义突变位点时不启动翻译终止而是继续向后进行翻译，获得有功能的全长蛋白。
I型黏多糖贮积症的病因，是相关基因发生无义突变，产生终止密码子UAG。研究者构建小鼠该突变基因mldua和Flag基因融合的载体（图1），以及针对该无义突变设计的sup-tRNA表达载体（产生的sup-tRNA能够识别UAG并携带酪氨酸Tyr,简写作sup-tRNATyr），将其导入细胞进行研究，发现与具有相似作用的化合物G418比较，sup--tRNA的作用更加显著（图2）；进一步利用重组腺相关病毒作为载体将sup-tRNA导入患病小鼠模型中，实验显示能够降低黏多糖过度积存，实现对该病症的有效治疗，其疗效可以持续半年以上。
从整体来看，G418在促进跨越无义突变位点继续翻译时引入的氨基酸较为随机，而sup-tRNA引入的氨基酸较为单一，且不会影响内源tRNA稳态，所以sup-tRNA在个体治疗中具有很高的安全性，因而在未来基因突变引起的疾病相关治疗中具有非常大的应用前景。
（1）侵染时，作为载体的重组腺相关病毒与靶细胞膜上的发生识别，引发内吞，进入细胞后释放单链DNA作为模板，利用宿主细胞的催化合成其互补DNA链，再经过过程产生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸较为单一，不影响内源tRNA稳态，我们还可推断，用于治疗的sup-tRNA在正常终止密码子处（填“能”或“不能”）继续往后翻译，具有很高的安全性。
（3）研究者构建mldua突变基因和Flag基因融合的载体，目的是通过检测来确定是否跨越无义突变位点继续向后翻译。实验结果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促进无义突变位点的翻译方面更加有效，支持这一结论的依据是：。
（4）有文献报道，已在近1000个不同的人类基因中发现了7500多个无义突变。常规的基因治疗需要为每种疾病设计独特的治疗策略，这将是一项耗费惊人的项目。据此说明sup-tRNA的应用价值。发布：2025/1/3 8:0:1组卷：28引用：1难度：0.6 -
3．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，自然界有些植物能产生几丁质酶催化几丁质水解从而抵抗真菌感染。通过基因工程将几丁质酶基因转入没有抗性的植物体内，可增强其抗真菌的能力。如图表示为获取几丁质酶基因而建立cDNA文库的过程。
（1）图示以mRNA为材料通过法获得cDNA，该方法依据的原理是，通过这种方法获得的基因中因缺乏和结构，导致将其直接导入受体细胞中不能复制和表达。
（2）与选用老叶相比，选用嫩叶更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（3）将从cDNA文库中获得的几丁质酶基因和质粒载体用酶和DNA连接处理后连接起来，构建基因表达载体，DNA连接酶催化形成的化学键是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：5引用：1难度：0.7
