大丽轮枝菌（一种丝状真菌）是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根侵染路径，研究人员利用绿色荧光蛋白基因（sGFP）转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如图（图中a链和 b链分别是相应基因转录模板链）。分析回答：
（1）过程①中，PCR扩增sGFP的原理是 DNA的半保留复制DNA的半保留复制，该过程除需要根据 sGFP两端（3′端）核苷酸序列sGFP两端（3′端）核苷酸序列设计特异性引物序列外，为保证sCFP正确插入到质粒中，还需要在引物的5′端添加限制酶识别序列，图中b链的黏性末端碱基序列（5′→3′）为 AGCTAGCT。
（2）过程②需要的工具酶是 DNA连接酶DNA连接酶。研究中将sGFP插入到构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是 保证sGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达保证sGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达。
（3）过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80℃左右后，再加入用无菌水配制的适宜浓度的潮霉素溶液，潮霉素不能与培养基一同灭菌的原因是 潮霉素在灭菌时结构被破坏潮霉素在灭菌时结构被破坏。
（4）选择过程③筛选培养得到的不同农杆菌菌落，分别提取细菌质粒DNA，并用BamHI和HindⅢ完全酶切可得 两两种长度不同的DNA片段。
（5）将导入重组质粒的农杆菌加入大丽轮枝菌的孢子细胞悬液中，在适宜条件完成转染后利用滤膜过滤得到孢子细胞，再在真菌培养基上培养获得菌落，最终通过检测 大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【答案】DNA的半保留复制；sGFP两端（3′端）核苷酸序列；AGCT；DNA连接酶；保证sGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达；潮霉素在灭菌时结构被破坏；两；大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度
【解答】
【点评】
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发布：2024/6/27 10:35:59组卷：2引用：2难度：0.7
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（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是。
（4）提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是。发布：2025/1/5 8:0:1组卷：2引用：2难度：0.6
