养殖家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加于饲料中，以提高家禽养殖效率。

（1）乳酸杆菌是动物胃肠道的优势细菌之一。家禽肠道内的乳酸杆菌通过细胞

无氧

无氧

呼吸产生乳酸等代谢产物，常见的乳酸菌除了乳酸杆菌，还有

乳酸链球菌

乳酸链球菌

。
（2）枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA自身延伸的方向为5′→3′。
①很多启动子具有物种特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择

B

B

（填写字母）。
A．枯草芽孢杆菌启动子
B．乳酸杆菌启动子
C．农杆菌启动子
②如表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。

限制酶	EcoRⅠ	BamHⅠ	KpmⅠ	MfeⅠ	HindⅡ
识别序列及其切割位点	5′-G↓AATTC-3′ 3′-CTTAA↑G-5′	5′-G↓GATCC-3 3′CCTAG↓G-5	5′-GGTAC↓C-3 3′-C↑CATGG-5	5′-C↓AATTG-3 3′-GTTAA↑C-5	5′A↓AGCTT-3′ 3′-TTCGA↑A-5′

根据上述信息，应使用限制酶

MfeⅠ、HindⅢ

MfeⅠ、HindⅢ

切割图1中质粒，使用限制酶

EcoRⅠ、HindⅢ

EcoRⅠ、HindⅢ

切割图2中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含抗生素

氨苄青霉素

氨苄青霉素

的培养基筛选，以得到转入W基因的乳酸杆菌。
（3）为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力，研究人员用液体培养基分别培养下表所示菌种。所得部分菌液接种于固体鉴定培养基上，另取部分菌液上清液测定酶活力，实验方案及测定结果如表所示。

菌种	酶活性相对值
乳酸杆茵	未检出
X	未检出
导入了重组质粒的乳酸杆菌	0.96

①表中的X应为

导入空质粒的乳酸菌

导入空质粒的乳酸菌

。
②在配制固体鉴定培养基时，除加入无机盐、刚果红、维生素、氮源、水外，还需要添加

纤维素、琼脂

纤维素、琼脂

。导入了重组质粒的乳酸杆菌在此培养基上应出现

以菌落为中心的透明圈

以菌落为中心的透明圈

。